Charakterisierung von Arteriogenese-Markern in einem arteriovenösen Shunt- Modell: das carotide Rete mirabile im Minischwein

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen in den Industrieländern und inzwischen auch in den Schwellenländern. Zu den kardiovaskulären Krankheiten gehören u.a. ischämische Krankheiten, bei denen die Gefäße stenosieren und das Perfusionsgebiet nicht ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt wird. Es werden Patienten beobachtet, die trotz hochgradiger Stenosen der Koronargefäße nur geringe Beschwerden aufweisen und einen Infarkt überleben. Es sind Menschen mit ausgeprägten Kollateralgefäßen, die weitlumige Arterien durch Proliferation ersetzen und die Perfusion an ihrer Stelle übernehmen. Ziel aktueller Studien ist es daher, eine rechtzeitige und wenig invsasive Induktion der Proliferation dieser Kollateralgefäße zu erreichen. Um das Kollateralwachstum genau zu erforschen, sind geeignete Modelle notwendig, die möglichst die Situation des Menschen widerspiegeln. Das Schwein, besonders das Minischwein, das mit seinem Gewicht näher am Menschen liegt als das Zuchtschwein, ist aufgrund der anatomischen Gegebenheiten, die dem Menschen ähneln, als Modell sehr gut geeignet. Das Minischwein besitzt ein Arteriengeflecht, das sogenannte Rete mirabile, das sich aus der A. pharyngealis ascendens in viele feine Arterienäste abzweigt und mit dem Geflecht der anderen Seite vereinigt. Dieses Arteriengeflecht wurde zur Untersuchung der Arteriogenese herangezogen. Von essentieller Bedeutung für die Stimulierung der Arteriogenese ist die Schubspannung , die sich aus dem Quotienten aus Kraft und Fläche zusammensetzt und als Initiator der Arteriogenese fungiert. Um die Schubspannung auf die Arterienwände im Rete mirabile zu erhöhen, wurde in zehn Minischweinen ein sogenannter arteriovenöser Shunt (AV-Shunt) eingebaut, welcher zwischen der A. carotis communis dextra und V. jugularis externa dextra zu liegen kommt. Ziel dieser Dissertation war es, das arterielle Rete mirabile des Minischweins mit dem künstlich geschaffenen AV-Shunt unter dem Aspekt einer möglichen Verwendung in der Arteriogeneseforschung zu untersuchen, sodass es im Anschluss auf die Eignung zur Testung proarteriogener Compounds überprüft und in der therapeutischen Arteriogenese eingesetzt werden kann. Die Tiere wurden direkt nach dem chirurgischen Eingriff (Kontrollgruppe) oder nach drei bzw. 14 Tagen Shuntbehandlung (Drei-Tage bzw. 14-Tage-Gruppe) geopfert und jedem das carotide Rete mirabile mit rechter und linker A. pharyngealis ascendens entnommen. Anschließend wurde das Arteriengeflecht in mehrere Segmente unterteilt und für RNA-Analyse und Immunhistochemie herangezogen. Bei der Analyse wurden auf RNA-Ebene Arteriogenesemarker untersucht, die in anderen Arteriogenesemodellen bereits gefunden wurden und als Arteriogenesemarker bekannt sind oder noch auf eine arteriogene Eigenschaft untersucht werden. Es sind die Zielgene TIMP-1, MMP-2, MCP-1, CD44, VEGFA, SDF-1 und Vimentin. Auf Proteinebene wurde das Modell mit Immunhistochemie nach wichtigen Eigenschaften der Arteriogenese, nämlich der Makrophageninvasion und Proliferation untersucht. Die RNA-Analyse brachte folgendes Ergebnis: TIMP-1, MCP-1 und CD44 waren in beiden Behandlungszeiten heraufreguliert, MMP-2 und SDF-1 waren nach drei Tagen herunterreguliert, Vimentin war in beiden Behandlungszeiten herunterreguliert und VEGFA zeigte insgesamt keine Deregulation. In der immunhistochemischen Untersuchung konnte bei der Ki67-Färbung ein Anstieg der Proliferation in der Drei-Tage Gruppe bezogen auf die Kontrollgruppe ermittelt werden, die in der 14-Tage-Gruppe auf die Ausgangslage zurückging. Die Makrophagenfärbung zeigte wie die Proliferationsfärbung nach drei Tagen einen deutlichen Anstieg an markierten Makrophagen, deren Zahl in der 14-Tage-Gruppe beinahe wieder die Ausgangslage annahm. Insgesamt lässt sich weiter zusammenfassen, dass die Mechanismen der Arteriogenese nach dem Einbau des AV-Shunts im Rete mirabile des Minischweins früh einsetzen und in diesem Modell die meisten der Gene, die in anderen Modellen als Arteriogenesemarker identifiziert wurden, die gleiche Expressionsrichtung zeigen. Um im Modell noch weitere Details aufzuklären, bedarf es einer Untersuchung dieses nach einem Tag AV-Shunt, um die unmittelbaren Folgen zu analysieren und für die mittelfristigen Folgen eine Untersuchung zwischen Tag 3 und 21 AV-Shunt-Behandlung. Für statistisch signifikantere Ergebnisse müsste die Tierzahl in den einzelnen Behandlungsgruppen erhöht werden. Danach könnten bekannte pharmakologische Substanzen wie GM-CSF oder MCP-1 als Positivkontrolle getestet werden, um eine therapeutische Arteriogenese zu bestätigen. Eine Eignung als Arteriogenesemodell ist zu erkennen, die Kombination der Faktoren, die das Modell innehat, scheint günstig im Hinblick auf die Aktivierung und Aufrechterhaltung der Arteriogenese zu sein.

Cardiovascular diseases are among the leading causes of death in industrialized countries and in the meantime also in emerging countries. Ischemic diseases belong to cardiovascular diseases, in which through a stenosis the vessels and the perfusion areas are not adequately supplied with oxygen and nutrients. Patients are observed, who have only mild symptoms despite a severe stenosis of the coronary arteries and survive a heart attack. There are people with definitive collateral vessels, which replace the wide- lumen arteries by proliferation and take over the perfusion in their place. Therefore the aim of current studies is a timely and less invsasive induction of arteriogenesis to achieve the proliferation of these collateral vessels. To explore the collateral growth exactly, suitable models are needed that reflect the human situation as far as possible. The pig, especially the mini pig, which is closer to people with its weight than the breeding pig are similar to man due to anatomical features and is well suited as a model. The minipig has a network of arteries, called the rete mirabile, which branches off from the ascending pharyngeal artery into many fine arterioles and combine with the network of arterioles of the other side. This arterial network was used in this study. Essential for the stimulation of arteriogenesis is the shear stress , which consists of the quotient of force and area, and acts as an initiator of arteriogenesis. To increase the shear stress on the artery walls of the rete mirabile, a so-called arteriovenous shunt (AV- shunt) was inserted in ten mini pigs, which connect the right common carotid artery with right external jugular vein. The right external carotid artery was closed proximal to the AV-Shunt. The aim of this study was to analyze, if the arterial rete mirabile of the minipig with the artificial AV-shunt is appropriate to examine the arterigenesis, so that it can be reviewed in connection to the suitability for testing proarteriogen compounds and used in therapeutic arteriogenesis. The animals were immediately sacrified after surgery (control) or after three or 14 days shunt treatment (three-day or 14-day group) and the carotid rete mirabile with each right and left ascending pharyngeal artery was removed. Then the artery network was divided into several segments and used for RNA analysis and immunohistochemistry. At the RNA level genes were analyzed which are already known as arteriogenic from other models of arteriogenesis and others of which a role of arteriogenic property is still searched for. The target genes were: TIMP-1, MMP-2, MCP-1, CD44, VEGFA, SDF-1 and Vimentin. On the protein level, important properties of arteriogenesis, namely the proliferation of the cells and the invasion of macrophages were invastigated with immunhistochemistry. The RNA analysis was as follows: TIMP-1, MCP-1 and CD44 were up-regulated in both treatment periods, MMP-2 and SDF-1 were down- regulated after three days, Vimentin was down regulated in both treatment periods and VEGFA showed no deregulation. In the immunohistochemical study with Ki67 antibody an increase of proliferating cells in the three-day group was determined relative to the control group, which fell in the 14-day group on the starting position. The macrophage staining revealed like the proliferation staining. It showed a significant increase of labeled macrophages after three days, whose positive number in the 14-day group almost went back to the starting position. Overall, it further can be concluded that the mechanisms of arteriogenesis after installation of the AV-shunt in the rete mirabile of the minipig start early and most of the genes that were identified in other models as factors of arteriogensis, showed the same expression direction. To elucidate further details in the model, it requires a study after a day of AV-shunt treatment to analyze the direct consequences and for the mid-term consequences an investigation between 3 and 21 days of AV- shunt treatment. For statistically significant results the number of animals should be increased in each treatment group. Then known pharmacological agents such as GM-CSF or MCP-1 could be tested as a positive control to confirm a therapeutic arteriogenesis. Suitability as an arteriogenesis model can be seen, the combination of factors, which holds the model seems to be favorable to the activation and maintenance of arteriogenesis.