This work presents projects focusing on the functions of native mucins in physiology and pathology. A variety of functional materials were designed using the outstanding chemical and biological properties of polyglycerol and its derivatives. To advance therapeutic strategies, this work aims to address the modulation of mucin crosslinks implicated in pathological conditions, while simultaneously developing a biomimetic system that accurately mimics the native mucin structure and functions. The first part of this thesis investigated the potential of using polyglycerol-based reducing agents to target disulfide crosslinks in pathological mucus as a potential treatment for muco-obstructive lung diseases. In the first project, thiol functionalities were combined with the anti-inflammatory scaffold dendritic polyglycerol sulfate (dPGS) aiming for a bifunctional compound (dPGS-SH). dPGS-SH induced a significant, dose-dependent chemical reduction of mucin crosslinks in cystic fibrosis sputum, as demonstrated by quantitative western blot analysis. Notably, dPGS-SH showed stronger mucolytic activity than clinically approved N-acetylcysteine (NAC). Moreover, it was proved that mucin multimer degradation relies on thiol-dependent effects using control experiments with the non-sulfated analogue (dPG-SH) and the precursor polymer (dPGS-NH2). Correspondingly, rheological experiments revealed a significant improvement in the viscoelastic properties of CF sputum following dPGS- SH treatment. In addition, no toxicity was observed on primary human nasal epithelial cells up to 5 mM dPGS-SH and the polymer mucolytic was shown to have slower autoxidation of thiols than NAC, even at 37°C. The unique polymeric structure, characterized by high molecular weight and multiple covalently bound thiol groups, distinguishes dPGS-SH from conventional small-molecule mucolytics. The second project aimed to evaluate the mucolytic potential of dithiol- functionalized dendritic polyglycerol (dPG-DTBA) in comparison to the small molecule dithiol reducing agent dithiobutylamine (DTBA). Multiple DTBA functionalities were conjugated to a polyglycerol scaffold via reductive amination. This strategy was intended to minimize alteration of the reducing properties of the dithiol motif, which was approved by determining similar thiol pKa values and disulfide reduction potential (E°’). Notably, the comparison of cell toxic effects on human bronchial epithelia cells revealed a substantially improved cell viability of dPG-DTBA compared to DTBA. Furthermore, it was demonstrated that polymer conjugation decelerates autoxidation and enhances reduction capacity. This was evidenced both by reduction assays using a model disulfide in solution and by macrorheological analysis of a synthetic disulfide hydrogel. Further, it was shown that dPG-DTBA reduces the mucin multimers of CF sputum significantly stronger than NAC with similar potency as unconjugated DTBA. The results obtained in both projects established a strong rationale for continuing the translational efforts of the presented mucolytic polymers. Further steps will focus on evaluating the effects of these compounds on mucus-producing human airway epithelial cells cultured at the air-liquid interface. Particular attention will be paid to mucociliary transport using particle tracking and rheological changes assessed using magnetic microwire rheology. In vivo studies employing bENaC mouse models are planned to further elucidate the therapeutic potential of the polymer mucolytics including mucolytic and anti-inflammatory readouts. Additionally, the pharmacological application parameters, such as compound stability and distribution during nebulization, must be systematically examined to optimize delivery and efficacy in clinical settings. In the third project, a dendronized polysulfate p(G1AAm-OSO3)PDS with an acrylamide- backbone as mucin-inspired polymer (MIP) was synthesized and its potential as inhibitor was evaluated using herpes simplex virus 1 (HSV-1). The morphology and inhibitory activity to its polymethacrylate analogue MIP was evaluated and compared. Both polymers showed mucin-like elongated fiber structure, as revealed in cryo- electron microscopy (cryo-EM) imaging, with similar relative stiffness. This suggests that backbone rigidity is not the determining factor for the worm-like morphology of both polymers. Both polymers showed potent HSV-1 inhibition with half-maximal inhibitory concentration (IC50) values in nanomolar range. Furthermore, the novel MIP displayed high cell compatibility, and prophylactic and therapeutic activities were evaluated using pre- and post-infection inhibition assays, further supporting its potential as an HSV-1 inhibitor. This thesis presented sulfation as initial functionalization of mucin-inspired polymers to integrate mucin function as polyelectrolyte. However, the functions of native mucins rely on complex effects involving charge- and glycan-mediated interactions with pathogens. Future investigations will focus on integrating mucin glycan functions, with the ultimate aim of achieving broad-spectrum inhibitory activity against various types of pathogens. Further, the crosslinking sites of the presented structures will be investigated with respect to their hydrogelation properties via thiol-disulfide interchange reactions. This approach enables the generation of a mucus- mimetic hydrogel system, which can serve as a potential platform to study pathogen interactions in 3D.
In dieser Arbeit werden Projekte vorgestellt, die sich mit den Funktionen nativer Muzine in der Physiologie und Pathologie befassen. Unter Nutzung der herausragenden chemischen und biologischen Eigenschaften von Polyglycerin und seinen Derivaten wurde eine Vielzahl funktioneller Materialien entwickelt. Um therapeutische Strategien voranzutreiben, zielt diese Arbeit auf die Modulation von Muzinvernetzungen ab, die bei pathologischen Zuständen eine Rolle spielen, während gleichzeitig ein biomimetisches System entwickelt wird, das die native Muzinstruktur und -funktionen genau nachahmt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Potenzial der Verwendung von Reduktionsmitteln auf Polyglycerinbasis untersucht, um Disulfidvernetzungen in pathologischem Schleim als potenzielle Behandlung von muko-obstruktiven Lungenerkrankungen zu testen. Im ersten Projekt wurden Thiol-Funktionalitäten mit dem entzündungshemmenden Gerüststoff dendritisches Polyglycerinsulfat (dPGS) kombiniert mit dem Ziel einer bifunktionellen Verbindung (dPGS-SH). dPGS-SH induzierte eine signifikante, dosisabhängige chemische Reduktion von Mucin- Crosslinks in Mukoviszidose-Sputum, wie durch quantitative Western-Blot-Analyse nachgewiesen wurde. Vor allem zeigte dPGS-SH eine stärkere mukolytische Aktivität als das klinisch zugelassene N-Acetylcystein (NAC). Darüber hinaus wurde anhand von Kontrollexperimenten mit dem nicht sulfatierten Analogon (dPG-SH) und dem Vorläuferpolymer (dPGS-NH2) nachgewiesen, dass der Abbau von Mucin-Multimeren auf thiolabhängigen Effekten beruht. Dementsprechend zeigten auch rheologische Experimente eine signifikante Verbesserung der viskoelastischen Eigenschaften von Mukoviszidose-Sputum nach Behandlung mit dPGS-SH. Darüber hinaus wurde bei primären menschlichen Nasenepithelzellen bis zu 5 mM dPGS-SH keine Toxizität beobachtet, und es zeigte sich, dass das polymere Mukolytikum eine langsamere Autoxidation von Thiolen aufweist als NAC, selbst bei 37°C. Die einzigartige Polymerstruktur, die sich durch ein hohes Molekulargewicht und mehrere kovalent gebundene Thiolgruppen auszeichnet, unterscheidet dPGS-SH von herkömmlichen niedermolekularen Mukolytika. Das zweite Projekt zielte darauf ab, das mukolytische Potenzial von Dithiol- funktionalisiertem dendritischem Polyglycerin (dPG-DTBA) im Vergleich zu dem niedermolekularen Dithiol-Reduktionsmittel Dithiobutylamin (DTBA) zu bewerten. Mehrere DTBA-Funktionalitäten wurden durch reduktive Aminierung an ein Polyglycerin-Gerüst konjugiert. Mit dieser Strategie sollte die Veränderung der reduzierenden Eigenschaften des Dithiol-Motivs minimiert werden, was durch die Bestimmung ähnlicher Thiol-pKa-Werte und Disulfid-Reduktionspotenziale (E°') bestätogt wurde. Der Vergleich der zelltoxischen Wirkungen auf menschliche Bronchialepithelzellen ergab, dass die Zellviabilität von dPG-DTBA im Vergleich zu DTBA erheblich verbessert wurde. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Polymerkonjugation die Autoxidation verlangsamt und die Reduktionskapazität erhöht. Dies wurde sowohl durch Reduktionstests mit einem Modelldisulfid in Lösung als auch durch makrorheologische Analyse eines synthetischen Disulfid-Hydrogels nachgewiesen. Darüber hinaus konnten gezeigt werden, dass dPG-DTBA die Muzin- Multimere im Sputum von Mukoviszidose signifikant stärker reduziert als NAC mit einer ähnlichen Wirksamkeit wie unkonjugiertes DTBA. Die in beiden Projekten erzielten Ergebnisse bilden eine hinreichende Grundlage für die Fortsetzung der translationalen Bemühungen, um die vorgestellten mukolytischen Polymere für die weitere biomedizinische Anwendung zu evaluieren. Weitere Schritte werden sich auf die Bewertung der Auswirkungen dieser Verbindungen auf schleimproduzierende Epithelzellen der menschlichen Atemwege konzentrieren, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert werden. Besonderes Augenmerk wird auf den mukoziliären Transport mittels Partikelverfolgung und auf rheologische Veränderungen gelegt, die mittels magnetischer Mikrodraht-Rheologie bewertet werden. In-vivo-Studien mit bENaC-Mausmodellen sind geplant, um das therapeutische Potenzial der polymeren Mukolytika, einschließlich der mukolytischen und entzündungshemmenden Eigenschaften, weiter zu erforschen. Darüber hinaus sollen die pharmakologischen Anwendungsparameter, wie z. B. die Stabilität und die Verteilung des Wirkstoffs während der Verneblung, systematisch untersucht werden, um die Verabreichung und Wirksamkeit im klinischen Umfeld zu optimieren. Im dritten Projekt wurde ein dendronisiertes Polysulfat p(G1AAm-OSO3)PDS mit einem Acrylamid-Backbone als Mucin-inspiriertes Polymer (MIP) synthetisiert und seine potenziellen Eigenschaften als Inhibitor am Beispiel des Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) evaluiert. Die Morphologie und die hemmende Wirkung mit dem Polymethacrylat-Analogon MIP wurde evaluiert und verglichen. Beide Polymere wiesen eine muzinähnliche, längliche Faserstruktur auf, wie die Kryo- Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zeigte, mit einer ähnlichen relativen Steifigkeit. Dies deutet darauf hin, dass die Steifigkeit des Rückgrats nicht der entscheidende Faktor für die wurmartige Morphologie beider Polymere ist. Beide Polymere zeigten eine starke HSV-1-Hemmung mit halbmaximalen Hemmkonzentrationswerten (IC50) im nanomolaren Bereich. Darüber hinaus zeigte das neue MIP eine hohe Zellkompatibilität, und die prophylaktischen und therapeutischen Aktivitäten wurden anhand von Prä- und Postinfektionshemmungstests bewertet, was sein Potenzial als HSV-1-Inhibitor weiter untermauert. In dieser Arbeit wurde die Sulfatierung als erste Funktionalisierung von Mucin- inspirierten Polymeren vorgestellt, um die Mucinfunktion als Polyelektrolyt zu integrieren. Die Funktionen nativer Muzine beruhen jedoch auf komplexen Effekten, die ladungs- und glykanvermittelte Wechselwirkungen mit Pathogenen beinhalten. Künftige Untersuchungen werden sich auf die Integration von verschiedenen Glykanfunktionen fokussieren, mit dem Ziel, eine Breitspektrum-Hemmwirkung gegen verschiedene Arten an Krankheitserregern zu erzielen. Außerdem werden die Vernetzungsstellen der vorgestellten Strukturen im Hinblick auf ihre Hydrogelierungseigenschaften mittels Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen untersucht. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung eines schleimähnlichen Hydrogelsystems, das als potenzielle Plattform für die Untersuchung von Pathogeninteraktionen in 3D dienen kann.
