Einfluss eines probiotischen Enterococcus faecium auf die natürliche Infektionsrate von Chlamydien beim Schwein

Abstract

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Erreger, die als kausales Agens vielfältiger Erkrankungen bei Mensch und Tier bekannt sind. Epidemiologisch besonders relevant ist zudem der klinisch inapparent persistierende Keimträger. Diese Tiere werden in Folge der persistenten Infektion nicht nur zum Erregerreservoir für andere Tiere, sondern scheiden somit auch potentielle Zooanthroponoseerreger aus. Daher sind auf der einen Seite die gesicherte Diagnosestellung der Infektion auf speziesspezifischem Level und auf der anderen Seite eine reduzierte Neuinfektionsrate der Tiere mit Chlamydien von höchster Wichtigkeit. In der vorliegenden Arbeit wurde der Darm als Habitat der Chlamydien, exemplarisch unter Zuhilfenahme von vier, sowohl konventionellen als auch modernen molekularbiologischen Methoden auf eine etwaige latente Chlamydieninfektion untersucht. Es kam die Anzucht des Erregers aus Fäzes und Mukosa mittels Zellkultur zum Einsatz. Dabei wurde eine speziesspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Fäzes, Ileum-und Kolonmukosa angewandt. Um die tatsächliche Infektion der Tier zu beweisen, wurden die Verfahren der Immunhistochemie (IHC) und Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) auf Proben des Dünn- und Dickdarms angewendet. Im Rahmen der FISH-Untersuchungen kam erstmalig ein hierarchisches Oligonukleotidsonden- Set am Gewebe zum Einsatz, um die Chlamydieninfektion des Darms darzustellen. Grund der systematischen Untersuchungen war es, die Auswirkung der Fütterung mit dem probiotischen Enterococcus faecium NCIMB 10415 auf die natürliche Neuinfektion des Darms mit Chlamydien zu erfassen. Hierfür wurden die Untersuchungen vergleichend zwischen einer Kontrollgruppe und einer Gruppe (Probiotikagruppe), die mit dem Enterococcus faecium Präparat supplementiertes Futter bekam, durchgeführt. Zunächst wurde der Infektionstatus der Muttersauen (n = 22) aus beiden Fütterungsgruppen erfasst, um dann Ferkel Chlamydia- positiver Muttersauen systematisch auf die Neuinfektion und die etwaigen Unterschiede in beiden Fütterungsgruppen zu untersuchen. Von fünf Muttersauen der Kontrollgruppe sowie der Probiotikagruppe wurden jeweils vier Ferkel zu den Terminen 14., 21., 35. und 56. Tag post partum auf eine Chlamydieninfektion untersucht. In der untersuchten Population konventioneller Muttersauen konnte zu einem hohen Prozentsatz (73%) eine latente Chlamydia suis Infektion diagnostiziert werden. Ebenso konnte das hohe Ausmaß der vertikalen Neuinfektionsrate der Ferkel dargestellt werden. Es zeigten sich deutliche Unterschiede in der Infektionsrate der Ferkel im Vergleich beider Fütterungsgruppen. So waren 85% (17/20) der Ferkel aus der Kontrollgruppe im Gegensatz zu 60% (12/20) der Ferkel aus der Probiotikagruppe mittels PCR als Chlamydia-Träger identifiziert worden. Diese Ergebnisse wurden durch die Darstellung einer höheren Infektionsrate des untersuchten Darmgewebes der Kontrollgruppe unter Verwendung der IHC und FISH bestätigt. Ebenso schien der Zeitpunkt der Infektion in der Probiotikagruppe verzögert. Die Anzucht der Chlamydien mittels Zellkultur, zum Nachweis einer latenten Chlamydieninfektion des Darms, erwies sich nicht als sichere diagnostische Methode. Die angewandte speziesspezifische Nested-PCR mit der Detektionsgrenze von <1 Inklusion- Forming-Unit /ml (1IFU/ml) war die senstitivste der angewandten Methoden. Im Vergleich der Verfahren zum Chlamydiennachweis im Gewebe zeigte sich, dass die FISH der IHC im Bezug auf die Nachweishäufigkeit fast gleichwertig war. Der Vorteil der FISH gegenüber der IHC bestand in der Möglichkeit mittels des hierarchischen Oligonukletidsonden-Sets zu einer Speziesdiagnose zu gelangen.

Chlamydiae are obligate intracellular pathogens which cause infections associated with a broad range of diseases in both livestock and humans. Epidemiologically persistently clinically inapparent infected animals are of particular importance. As a result of persistent infection these animals become a reservoir of pathogens for other animals, shedding these potential zoonotic pathogens. It is therefore of utmost importance to definitive diagnose infection on a species-specific level and to decrease the chlamydial load of these animals. The aim of this study was to examine the gut as a habitat of Chlamydiae utilizing conventional as well as modern molecular tools for determination of possible latent chlamydial infection. Cell cultures were used for cultivation of Chlamydiae from faeces or mucosal samples from swine. Species-specific polymerase chain reactions (PCR) were applied on samples from ileum, colon and faeces. To confirm active infection, immunhistochemistry (IHC) and fluorescence-in-situ-hybridisation (FISH) procedures were carried out with samples from the small and large intestines. In the course of the FISH examinations, a hierarchic oligonucleotide probe set was applied for the first time on tissue to demonstrate intestinal chlamydial infection. Reason of systematic examination was to performe a study comparing the efficacy of feeding with a probiotic strain of Enterococcus faecium NCIMB 10415 on the rate of natural infection of Chlamydiae in gut of swine. To determine this, we performed a study comparing two groups of animals, one that was fed with Enterococcus faecium (probiotic group) and one that did not receive probiotics (control group). Initially the carrier status of sows (n = 22) was determined in both feeding groups, then the piglets of Chlamydia-positive sows were examined systematically for carry-over infections and potential differences between these two groups. Therefore 4 piglets from each of five Chlamydia- positive sows (n=20 piglets) from either the control or probiotic group were examined for the frequency of Chlamydia at ages of 14, 21, 35 and 56 days post partum. In the examined population of conventional sows a high rate of latent Chlamydia suis infection could be determined. A clear difference in infection rate in the comparison of both groups could be detected. 85% (17/20) of the piglets from the control group were found to be Chlamydiae-positive by PCR, whereas Chlamydiae were found in only 60% (12/20) of piglets from the probiotic group. These results were confirmed by a higher infection rate of ileal and colon tissues by FISH and immuno¬histology. In addition to the reduced frequency of Chlamydiae-positive piglets in the probiotic group, the time point of infection was also delayed. Cell cultivation was not found to be a reliable diagnostic method for determining latent chlamydial infection of pig gut. The elabaated species-specific nested-PCR with detection limit of <1 IFU/ml was the most sensitive technique. The comparison of techniques for in- situ detection of Chlamydiae showed that IHC and FISH could be considered equivalent with regard to identification frequency. The advantage of FISH in comparison to IHC was the possibility to acquire a species-specific diagnosis using the developed hierarchic probe set.