Untersuchung der Stereospezifität und Positionsspezifität von Wirbeltier- Lipoxygenasen

Abstract

Lipoxygenasen (LOXen) bilden eine heterogene Gruppe von Dioxygenasen, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren oxygenieren. Auf diese Weise entstehen hochspezifisch chirale Hydro(pero)xyverbindungen, die vorwiegend an Stoffwechselwegen der Inflammation, Zelldifferenzierung und Zellwachstum beteiligt sind. LOXen kommen weit verbreitet bei Pro- und Eukaryonten vor und bestehen aus einer N-terminalen Regulatordomäne und einer C-terminalen Katalysatordomäne, welche das aktive Zentrum des Enzyms beherbergt. Neben ihrer Regulatorfunktion ist die N-terminale Domäne auch für die Membranbindung von LOXen bedeutsam. In jüngerer Vergangheit tendierte die Namensgebung von LOXen zu dem Namen des kodierenden Gens, zugleich sind jedoch noch weitere Bezeichnungen im Umlauf. Verschiedene Modelvorstellungen versuchen die Bildung der spezifischen Reaktionsprodukte zu erklären. Das Triadenkonzept der Positionsspezifität besagt, dass das Volumen der Substratbindungstasche die Lage des Substrates am aktiven Zentrum und damit die Reaktionsspezifität von ALOX12- und ALOX15-Isoformen beeinflusst. Bezüglich der Stereospezifität wurde in der Vergangenheit eine Hypothese formuliert, nach welcher S-Lipoxygenasen ein konserviertes Alanin und R-Lipoxygenasen ein konserviertes Glycin an einer kritischen Stelle ihrer Aminosäuresequenz tragen. Diese A vs G- Hypothese basiert darauf, dass Sauerstoff zu einem definierten Kohlenstoffatom der Substratfettsäure stereospezifisch dirigiert wird. Vor dem Beginn dieser Arbeit standen vor allem pflanzliche LOXen und Enzyme hochentwickelter Säugetiere im Mittelpunkt des Interesses. Zu LOXen niederer Wirbeltiere gab es außer der Verfügbarkeit vereinzelter Gensequenzen nur wenige Informationen. Vor diesem Hintergrund wurde hier erstmals eine LOX des Modelorganismus Zebrafisch (D. rerio) kloniert, als rekombinantes His-Tag Fusionsprotein in E. coli exprimiert und hinsichtlich ihrer protein-chemischen und enzymatischen Eigenschaften charakterisiert. Anschließend wurden verschiedene Enzymmutanten angefertigt, um die Anwendbarkeit verschiedener Konzepte der Reaktionsspezifität von LOXen zu untersuchen. Dabei wurde festgestellt, dass die Zebrafisch LOX1 eine S-lipoxygenierende Enzymspezies ist, obwohl sie nach der A vs. G- Hypothese als R-LOX einzuordnen wäre. Veränderungen der Triadendeterminanten haben ebenfalls gezeigt, dass auch dieses Konzept nicht auf das Zebrafischenzym übertragen werden kann. Durch Deletion des N-Terminus konnte gezeigt werden, dass die isolierte katalytische Domäne der Zebrafisch LOX1 katalytisch inaktiv ist und sich die Membranbindungseigenschaften verschlechterten. Im phylogenetischen Kontext der LOX-Familie sind Zebrafisch- LOXen älter als bisher erforschte LOX-Isoformen höherer Wirbeltiere, aber jünger als die prokaryontischen LOX-Isoformen, auf welche die A vs G-Hypothese oftmals ebenfalls nicht übertragbar ist. Die Zebrafisch LOX1 ist unentbehrlich für eine regelrechte Embryonalentwicklung, möglicherweise entspricht das Zebrafischenzym einem phylogenetischen Entwicklungsschritt von LOXen niederer Wirbeltiere zu den Säugetier ALOX12B-Isoenzymen oder den Epidermis-Typ-LOXen.

Lipoxygenases (LOXs) constitute a heterogeneous group of dioxygenases oxygenating polyunsaturated fatty acids. Due to LOX-activity, specific chiral hydro(pero)xyeicosatetraenoic acid metabolites are created, which contribute to inflammation, cellular differentiation and cell growth. LOXs are widely spread withing eukaryotes and prokaryotes, they consist of a regulatory N-terminal domain and a C-terminal catalytic domain, which contains the active site. Beside its regulatory function, the N-terminal domain is also important for membrane binding. More recently, the nomenclature of LOXs prones to give respect to the coding gene, whereas further terms are still common. Several concepts attempt to illuminate the formation of the specific reaction products. The triad concept of the positional specificity pictures the influence of the active site`s volume on the alignment of the substrate fatty acid and thus determining the positional specificity of ALOX12- and ALOX15-isoforms. Refering to the stereospecifity of LOXs, a concept was suggested in the past following the thesis that S-lipoxygenases carry a conserved alanine as a critical sequence determinant, while R-lipoxygenases carry a glycine at the same position. This so called A vs G-concept is based on the stereospecific direction of oxygen to the substrate fatty acid. Up to this investigation, the focus of LOX-research was mainly set on LOXs of plants and highly developed mammals and except the presence of genetic sequences, hardly any information of lower vertebrate LOXs was available. According to that a LOX of the model organism Zebrafish (D. rerio) was cloned for the first time, expressed as His-tag fusion protein in E. coli and characterized by its physicochemical and enzymatic properties. Subsequently, different mutations of the wild-type enzyme were prepared to prove current concepts of reaction specifity of LOXs. As a result, the Zebrafish LOX1 has to be classified as S-lipoxygenating enzyme species, although, regarding to the A vs G-concept, it should have been classified as R- lipoxygenating enzyme. Mutation of the triad concept sequence determinants also failed to verify its applicability related to the Zebrafish-enzyme. Deletion of the N-terminal domain revealed that the isolated catalytic domain is catalytic inactive and exhibits an impaired membrane binding. Considering the LOX-family from a phylogenetic point of view, Zebrafish-LOXs are older than LOXs of highly developed vertebrates but younger than prokayotic LOXs, which frequently rejected the A vs G-concept. The Zebrafish LOX1 is essential for regular embryonic development, suggesting a phylogenetic step from LOXs of lower developed vertebrates towards ALOX12B- or epidermis-type-LOXs of mammals.