Understanding the network of transcription factors, controlling pluripotency in human embryonic stem cells (ESCs) and human embryonal cancer cells (ECs), is essential for possible future therapies in medicine. Connecting the expression levels after ablation of OCT4 with potential binding sites allows a higher predictability of motif specific driven expression modules important for self-renewal and differentiation. In this study several peak analysis programs have been used to access a refined list of OCT4 targets in human EC cells and this data was connected to ES cell specific OCT4 binding and expression. A highly enriched POU-motif could be verified, discovered by a de novo approach, thus enabling connections to the distribution of OCT4 connected motifs like for the dimerisation factor SOX2. Selected targets have been validated, containing an OCT4-SOX2 binding site in their proximal promoter, and targets not connected to the classical HMG motif. Of those USP44 was further examined, containing a highly conserved POU-motif and GADD45G, having an impact on cell cycle regulation. The overexpression of GADD45G in EC cells resulted in an enrichment for upregulated genes, connected to differentiation pathways. Additionally preferred distances for the HMG and the POU motif could be observed, giving cause for additional binding modes than the classical HMG- POU consensus sequence. New OCT4 connected targets were discovered, and their importance in ESC differentiation and pluripotency was highlighted. Through a highly connected database, everyone can test now simple hypotheses based on their target genes. The use of NCCIT cells as a model to test pluripotency associated pathways in terms of potential functional binding sites has been demonstrated. Furthermore array based comparisons of gene expression levels between ES and EC cells have been conducted and new links have been established for further functional characterisation of these cells. Finally a ChIP-seq study revealed an unbiased genome wide view on putative OCT4 bound regions and suggested a genome wide binding pattern for OCT4 which is not centered for five prime proximal promoters.
Für die Entwicklung möglicher, zukünftiger Therapien in der Medizin ist das Verständnis jener Transkriptionsfaktoren, die die Pluripotenz kontrollieren und die Differenzierung blockieren, von entscheidender Bedeutung. Nach einer RNAi vermittelten Herunterregulierung von OCT4 wurde eine höhere Vorhersagbarkeit von Motiv spezifischen Expressionsmodulen, die wichtig für den Selbsterhalt und die Differenzierung der Zellen sind durch die Verknüpfung von differentiell regulierten Genen mit potentiellen Bindungsstellen ermöglicht. In dieser Arbeit wurden mehrere Programme für die Berechnung von Bindungsstellen verwendet und kombiniert, um eine Algorithmen unabhängigere Liste von potentiellen OCT4-Bindungsstellen in humanen embryonalen Karzinomzellen zu erhalten. Die daraus resultierenden Daten wurden mit spezifischen OCT4-Bindungsstellen und Expressionsmustern in embryonalen Stammzellen verknüpft. Durch den Einsatz von De Novo Motiverkennungsprogrammen konnte ein hoch angereichertes POU-Motiv verifiziert werden. Dadurch wurde wiederum die Analyse der Verteilungsmuster von OCT4 korrelierten Motiven ermöglicht, wie das HMG Motiv von SOX2, einem Heterodimerisierungspartners von OCT4. Es wurden Kandidaten validiert, die ein OCT4-SOX2 Bindungsmotiv im proximalen Promoterbereich enthielten, als auch solche, die nicht mit dem klassischen HMG Motiv verknüpft waren. Von diesen wurde USP44 weitergehend untersucht. Dieses Gen enthält eine hoch konservierte OCT4 Bindungsstelle. Des Weiteren wurde das Gen GADD45G untersucht, das einen Einfluss auf die Regulierung des Zellzyklus ausübt. Die Überexprimierung von GADD45G in EC Zellen führte zu einer Anreicherung von hochregulierten Genen, die mit Signalwegen der Differenzierung verknüpft sind. Zudem wurde ein Hinweis auf bevorzugte Entfernungsbeziehungen zwischen dem POU und dem HMG Motiv gefunden, die Grund zur Annahme geben, dass es neben dem klassischen HMG-POU Motiv zusätzliche Bindungsvarianten von OCT4 gibt. Auf der Grundlage Expressionsarray basierter Vergleiche zwischen zwei humanen Stammzellen- und zwei humanen embryonalen Karzinomzelllinien wurden neue Verknüpfungen zu annotierten funktionalen Signalwegen etabliert, um eine weitere Charakterisierung dieser Zellen zu ermöglichen. Mit Hilfe der ChIP-seq Technik wurde die genomweite Bindungsverteilung von OCT4 in humanen EC Zellen analysiert um einen weniger verzehrten Blick zu ermöglichen. Diese weist darauf hin, dass OCT4-Bindungsstellen nicht abhängig von der Entfernung zum Transkriptionsstartpunkt sind. Es konnten neue Kandidatengene identifiziert werden, die mit OCT4 verknüpft sind, und ihre Bedeutung für Differenzierungsprozesse und Pluripotenz hervorgehoben. Durch die Einrichtung einer hochvernetzten Datenbank, die alle relevanten OCT4 verwandten Daten verknüpft, ist es nun möglich, einfache Hypothesen basierend auf spezifischen Genlisten zu testen. Der Einsatz der EC Zelllinie NCCIT als Modellsystem für die Untersuchung Pluripotenz-assoziierter Signalwege im Hinblick auf potentielle funktionelle Bindungsstellen wurde erfolgreich demonstriert.