A-Ring Reduced Metabolites of Metandienone: Comprehension, Optimization and Application of Their Mass Spectrometric Analysis with Gas Chromatography

Abstract

The presented work depicts an in-depth approach on how to reach confident mass spectrometric analysis of metabolites of metandienone by gas chromatography. Metandienone is an anabolic androgenic steroid and a commonly used doping substance. Therefore, anti-doping testing strives to uncover its illicit intake by the detection of metandienone and its metabolites in athletes’ samples. In the following, the focus is mainly set on a reliable identification of the A-ring reduced metabolite structures 17ξ-methyl-5ξ-androstane-3ξ,17ξ-diol, 17ξ-hydroxymethyl-17ξ-methyl-18-nor-5ξ-androst-13-en-3ξ-ol and 17α-hydroxymethyl-17β-methyl-18-nor-5β-androst-1,13-dien-3α-ol in human urine samples in parallel. First of all, the synthesis of reference material and its structural characterization built the basis of these investigations. It found application in a study of mass spectrometric fragmentation of 17α-methyl-5ξ-androstane-3ξ,17β-diol and various isotopologues and enabled fundamental understanding on underlying fragment ion formation in electron ionization mass spectrometry. Further assessment of the analytical method was supported by the latter investigations and allowed developing a method for confident identification of the targeted analytes. Therefore, only chromatographic separation of inter alia diastereomeric molecule structures made it possible to overcome the encountered challenges of indistinguishable mass spectrometric signals. In the end, proof of concept was provided by the application of this method to an administration study with metandienone. Not only did it lead to the confident identification of known and unknown excreted metabolite structures but also gave a deeper insight into the human metabolism of anabolic androgenic steroids. Concluding, besides the support to maintain confidence in anti-doping analysis of metandienone this work generally contributes to the field of bioanalytics by highlighting the importance of integral understanding of the analytical conditions. In general, chemosynthetic knowhow was used to obtain reported reference material and corresponding isotopologues. Applied analytical techniques consist of nuclear magnetic resonance experiments, gas chromatography coupled to unit mass spectrometry, high-resolution mass spectrometry, and tandem mass spectrometry.

Die vorliegende Arbeit stellt einen umfassenden Ansatz für eine zuverlässige massenspektrometrische Analyse der Metaboliten von Metandienon mittels Gaschromatographie dar. Metandienon ist ein anaboles, androgenes Steroid und eine weit verbreitete Dopingsubstanz. Daher wird bei Anti-Doping-Kontrollen, die illegale Anwendung durch den Nachweis von Metandienon und seinen Metaboliten in den Proben von Sportlern aufgedeckt. Im Folgenden geht es vor allem um die zuverlässige Identifizierung der Metabolitstrukturen 17ξ-Methyl-5ξ-androstan-3ξ,17ξ-diol, 17ξ-Hydroxymethyl-17ξ-methyl-18-nor-5ξ-androst-13-en-3ξ-ol und 17α-Hydroxymethyl-17β-methyl-18-nor-5β-androst-1,13-dien-3α-ol mit reduziertem A-Ring in Urinproben von Menschen. Im ersten Schritt bildete die Synthese von Referenzmaterial und dessen strukturelle Charakterisierung die Grundlage für diese Untersuchungen. Es fand zunächst Anwendung in einer Studie zur massenspektrometrischen Fragmentierung von 17α-Methyl-5ξ-androstan-3ξ,17β-diol und verschiedenen Isotopologen und ermöglichte ein grundlegendes Verständnis der zugrundeliegenden Entstehung der Fragmentionen. Die anschließende genauere Betrachtung der Analysenmethode wurde von den obigen Untersuchungen unterstützt und ermöglichte die Entwicklung einer Methode zur zuverlässigen Identifizierung der Analyten. Nur durch die chromatographische Trennung von unter anderem diastereomeren Molekülstrukturen war es möglich, das Problem der durch Massenspektrometrie nicht unterscheidbaren Signale zu lösen. Der Machbarkeitsnachweis wurde schließlich durch die Anwendung dieser Methode im Rahmen einer Ausscheidungsstudie mit Metandienon erbracht. Sie führte nicht nur zu einer zuverlässigen Identifizierung bekannter und unbekannter Metabolitstrukturen, sondern ermöglichte auch einen tieferen Einblick in den Metabolismus anaboler androgener Steroide bei Menschen. Abschließend lässt sich sagen, dass diese Arbeit nicht nur dazu beiträgt, die Zuverlässigkeit der Anti-Doping-Analyse von Metandienon zu gewährleisten, sondern auch einen generellen Beitrag zur Disziplin der Bioanalytik leistet, indem sie die Bedeutung eines umfassenden Verständnisses der Analysebedingungen hervorhebt. Im Allgemeinen wurde chemosynthetisches Verständnis genutzt, um Referenzmaterial und entsprechende Isotopologe zu generieren. Die angewandten Analysetechniken bestehen aus Kernspinresonanz-Experimenten, Gaschromatographie, gekoppelt mit Massenspektrometrie, hochauflösender Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie.