Establishment and Systematic Benchmarking of Innovative Methods for Quantitative Interactome Mapping in Mammalian Cells

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) play a key role in probably all biological processes. Disease-causing missense mutations act through complicated genotype-to-phenotype associations often resulting in the perturbation of PPIs. Thus, the systematic discovery of PPIs is an important goal of network biology to understand the fundamental mechanisms of cellular function and dysfunction in health and disease. My aim was to establish and benchmark a new set of innovative mammalian cell-based PPI detection assays, DULIP and BRIP, that generate quantitative interaction scores and allow the identification of interactions at medium to high throughput. DULIP is a dual luminescence-based co-immunoprecipitation assay for interactome mapping in mammalian cells. In DULIP assays the bait and prey proteins are co-produced as Renilla and firefly luciferase fusions. In addition, the bait protein harbors a protein A tag that allows the precipitation of bait/prey protein complexes in microtiter plates. Through the use of two luciferase tags, bait and prey fusion protein expression can be quantified, as can the success of bait and prey precipitation. This enables the calculation of quantitative interaction scores for all tested protein pairs and allows for the generation of quantitative PPI data sets. In contrast, BRIP is a bioluminescence resonance energy transfer (BRET) and co-immunoprecipitation (co-IP)-based PPI detection assay for quantitative interactome mapping. For BRIP assays, the proteins of interest are co-produced as NanoLuc luciferase and protein A-mCitrine fusion proteins in mammalian cells. Interactions are detected sequentially in one experiment by two distinct PPI-detection principles. In intact cells, PPIs are quantified by BRET, followed by a luminescence-based detection of protein complex formation after co-IP. Protein expression can be detected in intact cells and cell lysates by measuring the luminescence and fluorescence activities of the NanoLuc and mCitrine fusion tags. Hence, the BRIP assay allows the calculation of two independent quantitative interaction scores, one in intact cells and the other after co-IP. Both assays were established and benchmarked on positive and random PPI reference sets. While the DULIP assay displayed a comparable sensitivity and specificity to other available PPI methods, the BRIP assay significantly detected more interactions of the positive reference set due to the combination of two interaction detection principles in one assay. Furthermore, the analysis of a reference set containing PPIs with known binding affinities demonstrated that both low- and high-affinity interactions can be detected with DULIP and BRIP assays. While both assays preferentially detected high-affinity interactions, the BRET read-out of the BRIP assay showed a higher sensitivity to detect low-affinity interactions compared to either the co-IP read-out of the BRIP or the DULIP assays. In studies using the interaction between the synaptic proteins Munc18 and Syntaxin-1, the effect of point mutations on interaction strength could be detected with both assays. However, only the in-cell BRET read-out of the BRIP assay allowed a quantitative assessment of the effects of single point mutations on the binding strength of the Munc18-Syntaxin-1 interaction. Taken together, my studies demonstrate that the DULIP and BRIP assays are innovative methods that are suitable for quantitative interactome research. They can be applied to generate comprehensive and quantitative PPI data sets in mammalian cells. Moreover, both assays are suitable for studying the effects of point mutations on interaction strength and allow the investigation of the influence of small- molecules on protein-protein interactions.

Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) spielen eine entscheidende Rolle in vermutlich allen biologischen Prozessen. Krankheitsrelevante Mutationen agieren über komplizierte Genotyp-zu-Phänotyp-Zusammenhänge, welche oft gestörte PPIs zur Folge haben. Entsprechend ist die systematische Untersuchung von PPIs ein wichtiges Ziel der Netzwerkbiologie, um fundamentale Mechanismen zellulärer Funktionen und Dysfunktionen in Gesundheit und Krankheit aufzuklären. Mein Ziel war es, neue und innovative Methoden – DULIP und BRIP – zur Detektion von PPIs in Säugertierzellen zu etablieren und zu benchmarken. Beide Methoden erlauben die Bestimmung quantitativer Interaktionsscores und die Detektion von PPIs im mittleren bis hohen Maßstab. DULIP ist ein dualer, Lumineszenz-basierter Coimmunpräzipitazions-Assay für die Interaktombestimmung in Säugertierzellen. Im DULIP Assay werden Köder und Beuteprotein als Renilla- und Firefly-Fusionsproteine koproduziert. Zusätzlich verfügt das Köderprotein über einen Protein A-Tag, welcher die Präzipitation von Proteinkomplexen in Mikrotitierplatten erlaubt. Durch die Verwendung von zwei Luciferase-Tags, kann die Köder- und Beuteproteinproduktion, sowie der Erfolg der Präzipitazion quantifiziert werden. Das erlaubt die Berechnung von quantitativen Interaktionsscores für alle getesteten Proteinpaare und die Generierung von quantitativen PPIs-Datensätzen. Im Gegensatz dazu ist der BRIP-Assay ein Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) und Coimmunpräzipitazions (co- IP)-basierter PPI-Detektions-Assay für die quantitative Interaktom-bestimmung. Für BRIP-Assays werden die Proteine von Interesse als NanoLuc-Luciferase- und Protein A-mCitrine-Fusionsproteine in Säugertierzellen koproduziert. Die Interaktionen werden sequenziell in einem Experiment durch zwei unterschiedliche PPI-Detektionsprinzipien detektiert. In intakten Zellen werden PPIs über BRET quantifiziert, worauf die Lumineszenz-basierte Detektion von Proteinkomplexen nach der co-IP erfolgt. Die Proteinproduktion von Köder- und Beuteproteinen kann in intakten Zellen und Zelllysaten durch die Messung von Lumineszenz- und Fluoreszenz-Aktivitäten der NanoLuc- und mCitrine-Tags erfolgen. Demzufolge eignet sich der BRIP Assay zur Berechnung von zwei unabhängigen quantitativen Interaktionsscores, einer in intakten Zellen und der andere nach der co-IP. Beide Assays wurden mit ähnlichen positiven und zufälligen PPIs-Referenzsets etabliert und gebenchmarkt. Während der DULIP- Assay eine vergleichbare Sensitivität und Spezifität zu bereits verfügbaren Methoden zeigte, detektierte der BRIP-Assay eine signifikant größere Anzahl an Interaktionen des positiven Referenzsets, aufgrund der Kombination von zwei PPIs-Detektionsprinzipien. Des Weiteren zeigte die Analyse eines PPIs- Referenzsets mit bekannten Affinitäten, dass sowohl gering-affine, als auch hoch-affine Interaktionen mit dem DULIP- und dem BRIP-Assay detektiert werden können. Während beide Assays vorzugsweise hoch-affine Interaktionen detektierten, zeigte die BRET-Komponente im Vergleich zur co-IP-Komponente des BRIP-Assays oder zum DULIP-Assay eine höhere Sensitivität bei der Detektion von gering-affinen Interaktionen. In Studien über die Interaktion zwischen Munc18 und Sytaxin-1 konnten die Effekte von Punktmutationen, welche die Interaktionsstärke beeinflussen, mit beiden Assays detektiert werden. Allerdings konnte nur mit der BRET Komponente des BRIP-Assay ein quantitativer Unterschied zwischen den Effekten der unterschiedlichen Punktmutationen auf die Interaktionsstärke der Munc18-Syntaxin-1-Interaktion aufgezeigt werden. Zusammengefasst konnte ich in meinen Studien zeigen, dass DULIP- und BRIP- Assays innovative Methoden sind, welche sich für quantitative Interaktomstudien eignen. Diese können angewandt werden, um umfassende und quantitative PPIs-Datensätze in Säugerzellen zu generieren. Weiterhin eignen sich beide Assays zur Messung der Effekte von Punktmutationen auf die Interaktionsstärke und zur Untersuchung von Einflüssen niedermolekularer Substanzen auf PPIs.