HMGA1- als neuer Koregulator der Peroxisomen Proliferator aktivierten Rezeptor gamma- vermittelten Transrepression in humanen Gefäßmuskelzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die molekulare Wirkungsweise des Kernrezeptors Peroxisomen Proliferator aktivierter Rezeptor γ (PPARγ) in der PPARγ-vermittelten Transrepression in humanen Gefäßmuskelzellen (VSMCs) charakterisiert. Zur Erforschung der PPARγ-abhängigen Transrepression in der Regulation bedeutender Gene für die Entstehung der Atherosklerose in der Gefäßwand wurde die Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) exemplarisch ausgewählt, welche eine wesentliche Funktion bei den pathologischen Gefäßwandumbauprozessen einnimmt. Auf der Suche nach neuen Interaktionspartnern von PPARγ wurde ein Expressionsprofil für humane Kernrezeptoren und Koregulatoren von humanen Gefäßmuskelzellen erstellt, wobei das Nicht-Histon Kernprotein High Mobility Group Protein A1 (HMGA1) als ein neuer Koregulator von PPARγ in der Gefäßwand identifiziert werden konnte. Die Ermittlung der HMGA1-Funktion für den PPARγ-vermittelten Transrepressionsmechanismus zeigte einerseits, dass die HMGA1 Depletion die PPARγ-abhängige Transrepression blockiert und somit zu einer Aufhebung der Pioglitazon-Wirkung führt und anderseits, dass in den mit HMGA1-überexprimierten Zellen die Pioglitazon-Stimulation zu einer verstärkten Reduktion der MMP-9 Expression führt. Diese Daten zeigen einen neuen Mechanismus anti-inflammatorischer Genregulation durch HMGA1 und PPARγ in VSMCs. Interaktionsstudien zeigten, dass PPARγ in Anwesenheit von HMGA1 sumoyliert wurde, wobei die Sumoylierungsstelle K367R entscheidend ist. Weiterhin konnte mittels Co-Immunopräzipitation bestätigt werden, dass es nach PPARγ-Aktivierung zur Komplexbildung von HMGA1 und SUMO E2 Ligase Ubc9 kommt. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experimente belegen, dass die ligand- abhängige PPARγ-Aktivierung zur Rekrutierung von PPARγ und HMGA1 zum MMP-9 Promotor führt. Desweiteren führte die Bindung von PPARγ dazu, dass der SMRT- Korepressor nicht mehr vom MMP-9 Promotor entfernt wurde und es somit zur Inhibierung der Transkription kommt. Diese Daten verdeutlichen, dass sowohl der neu identifizierten Kofaktor HMGA1 als auch die PPARγ Sumoylierung für die Transrepression in VSMCs notwendig ist. Weiterhin wurde die Relevanz der HMGA1 /PPARγ-Interaktionen auf die gefäßschützenden Funktionen von PPARγ im Tiermodell bestätigt. Die Dilatation der A. femoralis der Wildtyp als auch der HMGA1-defizienten Mäuse der Vehikelgruppe führte zu einer starken Neointimabildung. Die Behandlung mit Pioglitazon führte in den Wildtyptieren zu einer signifikanten Reduktion der Neointimabildung, wohingegen die Glitazon-Behandlung in den HMGA1-defizienten Mäusen keinen Einfluss auf die Neointimaausbildung zeigte. Diese in vivo-Daten zeigten, dass der Pioglitazon- vermittelte Gefäßschutz in den HMGA1-defizienten Mäusen aufgehoben wurde und bestätigen die Bedeutung des HMGA1 Proteins in der PPARγ-vermittelten Transrepression. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit der molekulare Signalweg für die PPARγ-abhängige Transrepression mit dem HMGA1-Protein als entscheidenden neuen Kofaktor in Gefäßmuskelzellen charakterisiert.

The nuclear receptor peroxisome proliferator–activated receptor-γ (PPARγ) is an important regulator of gene transcription in vascular cells and mediates the vascular protection observed with antidiabetic glitazones. We focused on the molecular mechanism of ligand-dependent transrepression in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and their impact on the vascular protective actions of PPARγ. Here, we report a molecular pathway in VSMCs by which ligand-activated PPARγ represses transcriptional activation of the matrix-degrading matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) gene, a crucial mediator of vascular injury. PPARγ-mediated transrepression of the MMP-9 gene was dependent on the presence of the high-mobility group A1 (HMGA1) protein, a gene highly expressed in vascular smooth muscle cells, newly identified by oligonucleotide array expression analysis. Using siRNA against HMGA1 in VSMCs completely prevented MMP-9 inhibition by glitazone-activated PPARγ and HMGA1 overexpression resulted in strongly pioglitazone-induced MMP-9 repression surporting the importance of HMGA1. The Role of PPARγ SUMOylation was determined by transactivation assays. PPARγK367R did not inhibit the MMP-9 promoter, whereas PPARγK77R retained full transrepression activity. To further support the involvement of SUMOylation we studied the interaction between HMGA1 and the SUMO E2 ligase Ubc9 by immunoprecipitation experiments and we could show that after PPARγ-ligand stimulation PPARγ forms a complex with HMGA1-Ubc9 which likely facilitates its SUMOylation. ChIP experiments demonstrate that after PPARγ ligand stimulation, HMGA1 and PPARγ were recruited to the MMP-9 promoter, which facilitated binding of the silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor (SMRT), a nuclear corepressor involved in transrepression. ChIP assays using siRNA against HMGA1 show a complete loss of PPARγ binding to the MMP-9 promoter. Consistent with these findings, HMGA1´s relevance for vascular PPARγ signalling was underlined by the complete absence of vascular protection through a PPARγ-ligand in HMGA1-/- mice after arterial wire-injury. To conclude, our data suggest that ligand-dependent formation of HMGA1-Ubc9-PPARγ complexes facilitates PPARγ SUMOylation, which results in the prevention of SMRT corepressor clearance and induction of MMP-9 transrepression. These data provide new information on PPARγ-dependent vascular transcriptional regulation and help us to understand the molecular consequences of therapeutic interventions with PPARγ ligands in the vasculature.