Development of a reverse genetics system for iridoviruses based on TAR cloning in Saccharomyces cerevisiae, including the establishment of a novel method for genomic DNA rescue using a heterologous fish helper virus.

Abstract

A reverse genetics system (RGS) for iridovirus frog virus 3 (FV3, Ranavirus rana1), one of the key members in Megaviricetes class, was successfully developed using transformation- associated recombination (TAR) cloning in yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enabled the construction of BAC-YAC constructs containing the full-length FV3 genome, from which infectious virus could be rescued. One of the constructed clones - FV3-S3Ar - retained key phenotypic and functional characteristics of the parental FV3, demonstrating the integrity of the construct. To evaluate the established RGS applicability, a recombinant virus was generated by replacing ORF64R with an enhanced green fluorescent protein (EGFP), constructing a reporter virus FV3-Δ64R-EGFP. The resulting reporter virus showed stable replication and persistent EGFP expression over several passages. This confirmed the platform’s suitability for targeted gene manipulation and the viability of the system. An alternative rescue method using the heterologous fish ranavirus Largemouth bass virus virus (LMBV, Ranavirus micropterus1) as a helper virus was developed and validated. This approach proved effective for virus rescue and may provide a safer and more straightforward option compared to the use of a traditional UV-irradiated helper virus. Overall, this system offers a reliable and flexible tool for the genetic mutagenesis of FV3 and paves the way for future investigations into viral gene function, pathogenicity, and potential vaccine development.

Ein revers-genetisches System (RGS) für das Iridovirus frog virus 3 (FV3, Ranavirus rana1), einen bedeutenden Vertreter der Klasse Megaviricetes, wurde erfolgreich mittels transformation-assoziierter Rekombination (TAR) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae entwickelt. Mit dieser Methode konnten BAC-YAC-Konstrukte erzeugt werden, die das vollständige FV3-Genom enthalten und aus denen infektiöse Viren gewonnen werden konnten. Einer der konstruierten Klone – FV3-S3Ar – behielt wesentliche phänotypische und funktionelle Eigenschaften des parentalen FV3 bei, was die Integrität des Konstrukts bestätigte. Zur Überprüfung der Anwendbarkeit des RGS wurde ein rekombinantes Virus erzeugt, bei dem das ORF64R durch das Gen Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) ersetzt wurde. Das daraus resultierende Reportervirus FV3-Δ64R-EGFP zeigte stabile Replikation und eine anhaltende EGFP-Expression über mehrere Passagen hinweg, welches die Eignung der Plattform für gezielte Genmanipulationen bestätigt hat. Zusätzlich wurde eine alternative Methode zur Virus Rekonstituierung entwickelt und validiert, bei der heterolog das Fisch-Ranavirus Largemouth Bass Virus (LMBV,Ranavirus micropterus1) als Helfervirus eingesetzt wurde. Dieser Ansatz erwies sich als effektiv und stellt eine Alternative zur traditionellen Verwendung von UV-inaktivierten Helferviren dar. Insgesamt bietet dieses System ein zuverlässiges und flexibles Werkzeug für die genetische Mutagenese von FV3 und ebnet den Weg für zukünftige Untersuchungen zur Funktion viraler Gene, Pathogenität und der Entwicklung potenzieller Impfstoffe.