Opioide zur lokalen Ausschaltung schwerster Schmerzen bei Verletzung der Haut: In vitro Charakterisierung von nanostrukturierten Trägersystemen

Abstract

Systemisch applizierte Opioide sind die Therapie der Wahl zur Behandlung schwerster Schmerzen verursacht durch Verletzung der Haut. Die damit assoziierten Nebenwirkungen sind für den Patienten belastend und im Falle einer Atemdepression auch lebensbedrohend. Eine lokale Behandlung dieser Wunden mit topisch appliziertem Morphin ist aufgrund der Existenz von Opioidrezeptoren in der Haut prinzipiell möglich. Dadurch können Nebenwirkungen reduziert, eventuell sogar ganz vermieden werden, da die zusätzlich erforderliche systemische Dosis durch die topische Applikation von Morphin reduziert werden kann. Der regelmäßig stattfindende Verbandswechsel ist für den Patienten besonders schmerzhaft und birgt die Gefahr, das neugebildete Epithel zu zerstören. Ziel dieser Arbeit war es, einen geeigneten Träger für Morphin zu entwickeln, um eine kontinuierliche Wirkstofffreisetzung über mindestens 24 Stunden zu gewährleisten. Des Weiteren sollten die Biotransformation von Morphin in der Haut und die (per-) kutane Resorption untersucht werden. Zunächst wurde die im Arbeitskreis entwickelte HPLC-Methode zur Trennung von Morphin und Hydromorphon (interner Standard) weiterentwickelt und optimiert, um Morphin in den verschiedenen Testmatrizes quantitativ bestimmen zu können. Durch Einführung eines Fluoreszenz-Detektors konnte das untere Quantifizierungslimit für Morphin von 1 auf 0,1 µM erniedrigt werden, wodurch die Quantifizierung des Wirkstoffes in rekonstruierter Haut möglich wurde. Linearität, Auflösung sowie Intra- und Interday-Variabilität zeigen, dass die Methode reproduzierbare und valide Ergebnisse liefert. Im nächsten Schritt wurde die Biotransformation von Morphin in der Haut durch Untersuchung der Genexpression der UDP-Glucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7), dem wichtigsten Enzym des Morphinstoffwechsels, in primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten sowie der Keratinozytenzelllinie HaCaT bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass UGT2B7 in den drei Zelltypen nicht bzw. nur in Spuren exprimiert wurde. Zur Bestätigung der Ergebnisse erfolgte zusätzlich noch ein Metabolisierungstest mit Hautmikrosomen. Die beiden Metabolite Morphin-3- und Morphin-6-glucuronid wurden nur in Spuren gebildet, so dass in vivo nicht mit einem nennenswerten Metabolismus von Morphin in der Haut zu rechnen ist. Die Entwicklung einer Darreichungsform zur topischen Anwendung von Morphin war zunächst fokussiert auf feste Lipidnanopartikel (SLN) als Trägersystem, das eine langanhaltende und kontinuierliche Wirkstofffreisetzung ermöglichen kann. Es zeigte sich aber, dass SLN aufgrund der sehr geringen Einschlusseffizienz sowie der schnellen Freisetzung aus der Dispersion nicht als Trägersystem für die kontinuierliche Morphin-Freisetzung geeignet sind. Auch die Einbettung der SLN in Hydroxyethylcellulose Gel DAB verbesserte die Freisetzungskinetik nicht nennenswert. Vielmehr zeigte sich durch Vergleich mit Morphin-beladenem Hydroxyethylcellulose Gel DAB, dass das Hydrogel alleine eine deutlich längere Freisetzung gewährleistet, weshalb im nächsten Schritt die Eignung von Poloxamer-Gelen als Trägersystem für Morphin untersucht wurde. Lutrol® F 127 25 % Hydrogel wies dabei die langsamste Morphin-Freisetzung auf und wurde näher charakterisiert. Mit steigender Konzentration an Gelbildner, d.h. mit enger werdenden Diffusionswegen innerhalb des Gels, nahm die Freisetzungs¬geschwindigkeit ab. Ein signifikanter Unterschied zwischen pH 6,0 und 7,4 des Gels auf die Morphin-Freisetzung wurde nicht beobachtet. Zuletzt wurde die Morphin-Freisetzung aus dem Lutrol® F 127 25 % Hydrogel im Vergleich zu Hydroxyethylcellulose Gel DAB über einen Zeitraum von 48 Stunden bestimmt. Das Poloxamer-Gel erhöhte die Freisetzungsdauer von 12 (Hydroxyethylcellulose Gel DAB) auf 24 Stunden und eignet sich damit als Träger für Morphin, um eine langanhaltende kontinuierliche Wirkstofffreisetzung zu ermöglichen. Der freisetzungsverzögernde Effekt des Poloxamer-Gels resultierte auch in einer langsameren Hautresorption. Sowohl unter Finite als auch Infinite Dose Bedingungen war nach 3 bzw. 6 Stunden eine größere Menge an Morphin aus Hydroxyethylcellulose Gel DAB in Epidermis und Dermis (rekonstruierte Humanhaut) penetriert als aus dem Lutrol® F 127 25 % Hydrogel. Auch die Permeation von Morphin aus diesem Gel erfolgte schneller und es wurden deutlich höhere Mengen an Morphin im Akzeptormedium nachgewiesen. Freisetzungsverhalten und (per-) kutane Resorption von Morphin lassen bei Applikation in Form des Lutrol® F 127 25 % Hydrogels aufgrund der kontinuierlichen Wirkstofffreisetzung über 24 Stunden eine erfolgreiche Behandlung schwerer Verletzungen der Haut erwarten, da dies bei dem bislang in klinischen Studien eingesetzten IntraSite Gel der Fall ist. Vor Einsatz in weiteren klinischen Studien müssen allerdings die (per-) kutane Resorption an geschädigter Haut und der Einfluss der Gele auf die Wundheilung untersucht werden.

Pain caused by severe skin wounds asks for the treatment with systemically applied opioids which is associated with severe and encumbering adverse effects like respiratory depression. Due to the presence of opioid receptors in the skin the topical treatment with morphine is possible. Thus, the additionally required systemic dose and first of all the adverse effects may be reduced. Besides, standardized wound management including regular changes of the wound dressing is really painful for the patient and bears the risk of destroying the newly generated epithelia. The main objective of this work was the development of a suitable carrier system for morphine which provides a long-lasting, sustained drug release. In addition, biotransformation of morphine and percutaneous absorption were also investigated. Initially an HPLC-method was developed further and optimized for the quantification of morphine and hydromorphone (internal standard) in different matrices based on a method previously developed within the work group. The lower limit of quantification could be decreased from 1 to 0.1 µM using a fluorescence detector in combination with an UV-detector and the quantification of morphine in reconstructed human skin became possible. Linearity, resolution as well as intraday and interday variety show that the results obtained with this method are reproducible and valid. In order to investigate the biotransformation of morphine in the skin, gene-expression of UDP-glucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7), the major metabolizing enzyme of morphine, was determined in normal human keratinocytes and fibroblasts as well as the keratinocyte cell line HaCaT. It was shown that UGT2B7 is not or only expressed in traces in the different cell types. In order to confirm these findings a biotransformation experiment with human skin microsomes was performed. Two hours of microsomal incubation resulted in a negligible formation of metabolites. Thus a considerable biotransformation of morphine in the skin can be excluded. Solid lipid nanoparticles (SLN) which can provide sustained release were initially considered as a possible carrier system for morphine. It could be shown that SLN are not appropriate as a carrier system for morphine due to the low entrapment efficiency and the fast morphine release from the SLN-dispersion. The embedding of the particles in hydroxyethylcellulose gel DAB did not improve release kinetics in an adequate way. In fact, the hydrogel itself showed an even slower morphine release compared to the SLN-loaded gel. Thus, in the next steps poloxamer gels were investigated as a carrier system for morphine. Since the Lutrol® F 127 25 % hydrogel showed the slowest morphine release it was further characterized. It could be shown that release rates decreased with increasing concentration of the gel forming agent due to decreasing diffusion pass ways within the gel. No significant difference in morphine release could be observed using gels with pH 7.4 and 6.0. Finally, morphine release from Lutrol® F 127 25 % hydrogel over a period of 48 hours was determined in comparison to hydroxyethylcellulose gel DAB. Release studies revealed that the Lutrol® F 127 25 % hydrogel is an appropriate carrier system for morphine: it provided a constant morphine release up to 24 hours, whereas 100 % of morphine were released after 12 hours from the reference gel. The sustained release behavior of the poloxamer gel resulted also in a slower percutaneous absorption. In comparison to the poloxamer gel a higher amount of morphine penetrated in epidermis and dermis (reconstructed human skin) from the reference gel over a period of 3 or 6 hours, respectively, both under finite and infinite dose conditions. Hydroxyethylcellulose gel DAB provided also a higher morphine permeation. Release behavior and percutaneous absorption of morphine from Lutrol® F 127 25 % hydrogel give reason to expect a successful treatment of severe skin wounds due to the long-lasting morphine release over 24 hours and the positive analgesic effect of IntraSite gel shown in clinical studies. Before the poloxamer gel can be used in clinical studies, percutaneous absorption of morphine in wounded skin and the influence of both gels on the wound healing process must be investigated.