Funktionelle Analyse von Dickkopf im Seeigel Strongylocentrotus purpuratus

Abstract

In Vertebraten ist das Dkk1-Gen notwendig für die Kopfinduktion durch den Spemann'schen Organisator. Dabei beruht die induzierende Eigenschaft auf der Fähigkeit von Dkk1, den Wnt/b-Catenin-Signalweg zu inhibieren. Daneben existieren in Vertebraten noch drei weitere Dickkopf-Gene, deren Funktionen aber weitestgehend unbekannt sind. Wie die Sequenzierung des Seeigelgenoms gezeigt hat, besitzt der Seeigel zwei Dickkopf-Gene (SpDkk1 und SpDkk3), über deren Funktionen aber bislang noch nichts bekannt ist. Lediglich das Expressionsmuster von SpDkk1 ist bekannt und deutet darauf hin, dass SpDkk1 an der Endomesoderm-Differenzierung sowie an der Bildung des apikalen Ektoderms beteiligt ist. In dieser Arbeit durchgeführte phylogenetische Analysen belegen, dass die beiden bei der Genomanalyse identifizierten Dickkopf-Gene tatsächlich Mitglieder der Dickkopf- Familie sind. Außerdem wurde gezeigt, dass es sich bei diesen beiden Genen um die Ursprungsgene handelt, aus denen sich durch Genomduplikationen die weiteren Mitglieder der Vertebraten- Dickkopf-Gene entwickelt haben. Des Weiteren konnte durch Überexpression und Depletion von SpDkk1 bzw. SpDkk3 sowie durch Promotoranalysen von SpDkk1 gezeigt werden, dass Dkk1 auch im Seeigel ein Inhibitor und zugleich ein Zielgen des Wnt/b-Catenin-Signalwegs ist. Aufgrund dieser Fähigkeit fungiert es als Regulator der Kernel-Gene und wirkt dadurch auf die Endomesoderm- Differenzierung des Seeigelembryos. Darüber hinaus ist Dkk1 wie auch Dkk3 an der Bildung von serotonergen Zellen beteiligt. In einem WISH Screen wurden zudem 13 weitere Gene identifiziert, die während der Embryogenese im apikalen Ektoderm exprimiert werden. Unter ihnen befinden sich drei, die spezifisch in serotonergen Zellen exprimiert sind. Durch verschiedene Perturbations- experimente und anschließende qPCR-Analysen wurde ein GRN für das apikale Ektoderm und serotonerge Zellen erstellt. Dabei zeigte sich, dass sich Dkk1 an der Spitze dieses GRN befindet und durch Regulation verschiedener Transkriptionsfaktoren erheblichen Einfluss auf die Bildung von serotonergen Zellen hat. Auch Dkk3 ist an der Regulation von serotonergen Zellen beteiligt, allerdings ist dessen Einfluss innerhalb des GRN auf eine kleinere Anzahl von Genen begrenzt. Dies zeigt, dass Dkk1 bereits im Seeigel ein wichtiges Organisator-Molekül ist, das in der Endomesoderm-Differenzierung und der Neurogenese involviert ist. Außerdem ist nicht nur seine Eigenschaft zur Inhibierung des Wnt/b-Catenin-Signalwegs evolutionär konserviert, sondern auch die Fähigkeit, anteriore Strukturen zu induzieren.

In vertebrates the Dkk1 gene is necessary for head induction by the Spemann organizer. The inductive capacity is based on the ability of the Dkk1 protein to inhibit the wnt/b-catenin signaling pathway. Furthermore there are three additional dickkopf genes in vertebrates, whose functions are still unknown. As shown by genome sequencing, two different dickkopf genes exist in the sea urchin genome (SpDkk1 and SpDkk3). Neither the functions of these are known so far. Only the expression pattern of SpDkk1 is available and indicates that SpDkk1 is involved in the differentiation of the endomesoderm and the formation of the apical ectoderm. The phylogenetic analysis performed for this thesis revealed that both identified sea urchin dickkopf genes are indeed members of the dickkopf family and that they are the anchestor genes from which the different vertebrate dickkopf genes were evolved by genome duplications. Furthermore gain-of-function and loss-of-function studies of SpDkk1 and SpDkk3 as well as promotor analysis of SpDkk1 demonstrate that also sea urchin Dkk1 is an inhibitor of the wnt/b-catenin signaling pathway and a target of this pathway at the same time. Due to this ability Dkk1 acts as a regulator of the kernel genes and thereby affects the endomesoderm differentiation of the sea urchin embryo. Apart from that Dkk1 as well as Dkk3 participate in the formation of serotonergic cells. In a WISH screen 13 other genes were identified, which are expressed in the apical ectoderm during sea urchin embryogenesis. Among them are three genes, which are specifically expressed in serotonergic cells. By different genetic perturbation experiments followed by qPCR analysis a GRN for the apical ecoderm and serotonergic cells was generated. Thus it appears that Dkk1 acts at the top of the GRN for the apical ectoderm and serotonergic cells and that Dkk1 has an important influence on the formation of serotonergic cells by regulating several transcription factors. Also Dkk3 is involved in the regulation of serotonergic cells, but its influence is limited to only a few genes. Overall the results showed that already in the sea urchin Dkk1 is an important organizer molecule that participates in the differentiation of endomesoderm and neurogenesis. It is not only its ability to inhibit the wnt/b-catenin signaling pathway which is evolutionary conserved, but also its ability to induce anterior structures.