The dual combination therapy panobinostat-lorlatinib is effective against neuroblastomas harboring genomic TERT rearrangements and ALK mutations

Abstract

Therapy of patients with high-risk neuroblastoma remains a clinical challenge. Despite considerable efforts in the last decades to improve outcome, survival rates persist low at 60% at initial diagnosis and 20% at relapse. New therapeutic approaches are therefore needed. Telomere maintenance mechanisms are major carcinogenic drivers. Recently, genomic TERT rearrangements have been found in high-risk neuroblastomas. Neuroblastomas that exhibit mutations in the RAS-MAPK pathway in addition to telomere maintenance mechanisms constitute a distinct subset of high-risk tumors with especially dire prognosis. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, induces cell cycle arrest and apoptosis in TERT-driven neuroblastoma models in vitro and in vivo. As drug combinations are indispensable to achieve sufficient therapeutic efficacy and mitigate the risk of therapy resistance, our goal was to identify compounds that act synergistically with panobinostat in a panel of eight neuroblastoma cell lines carrying TERT rearrangements and/or ALK alterations. We tested four conventional chemotherapeutics (doxorubicin, irinotecan, oxaliplatin, temozolomide) and five targeted therapeutics (bortezomib, dasatinib, IBET-762, lorlatinib, rapamycin) with the CellTiter-Glo metabolic activity assay and the SynergyFinder platform. The combination of panobinostat with doxorubicin, temozolomide, bortezomib, dasatinib, lorlatinib and rapamycin synergistically reduced metabolic activity up to 95% in CLB-GA and GI-ME-N neuroblastoma cells. With the exception of panobinostat-bortezomib, all of the six 2-drug regimens synergistically induced caspase-3/7 activity as assessed by a linear mixed-effects model. We measured the most effective and synergistic caspase-3/7 induction by combining panobinostat with lorlatinib or with rapamycin. PARP cleavage was examined by Western blotting and cell viability through Trypan blue staining for these 2-drug regimens. Cell viability data were evaluated by Mann-Whitney U tests. Both read-outs demonstrated a particularly potent induction of apoptosis by the 2-drug regimen panobinostat-lorlatinib over a broad clinically achievable concentration spectrum. We affirmed these results in six neuroblastoma cell lines characterized either by one of the two most common the ALK hotspot mutations (p.R1275Q or p.F1174L) or an amplification of the ALK gene. In ALK mutated neuroblastoma cell lines (LAN-5, Kelly, SK-NSH), metabolic activity was reduced by 82-99%. Activity inhibition reached 95-99% in ALK amplified cell lines (IMR-5, IMR-32, NB-1). The Bliss synergy score ranged between 8.8-18.6 in ALK 2 mutated and between 3.3-7.8 in ALK amplified neuroblastoma cells. In summary, this work shows high efficacy by the 2-drug combination of panobinostat with lorlatinib against ALKdriven high-risk neuroblastoma with and without TERT rearrangements and thus warrants further in vivo validation.

Trotz intensiver Forschungsaktivität stellt das Hochrisko-Neuroblastom weiterhin eine große klinische Herausforderung dar. Die Überlebenswahrscheinlichkeit bei Erstdiagnose liegt bei 60%, im Rezidiv beträgt sie unter 20%. Neue Therapiestrategien werden deshalb dringend benötigt. Telomererhaltungsmechanismen einschließlich genomischer TERT Rearrangements wurden jüngst als onkogene Treiber von Hochrisko-Neuroblastomen identifiziert. Neuroblastome, die zusätzlich zu Telomererhaltungsmechanismen auch Mutationen im RAS-MAPK-Signalweg aufweisen, bilden eine Subgruppe von Hochrisko- Neuroblastomen mit besonders schlechter Prognose. Der Histondeacytelase Inhibitor Panobinostat löst in TERT-rearrangierten Neuroblastomzellen Zellzyklusarrest und Apoptose aus. Da Medikamentenkombinationen essentiell für eine effektive Therapie und die Vermeidung von Resistenzentwicklung sind, war es das Ziel dieser experimentellen Arbeit, synergistisch wirkende Medikamente in der Kombination mit Panobinostat zu identifizieren. Dafür wählten wir Neuroblastomzelllinien mit TERT Rearrangement und/oder ALK Alterationen aus und untersuchten vier Chemotherapeutika (Doxorubicin, Irinotecan, Oxaliplatin, Temozolomid) und fünf zielgerichtete Therapeutika (Bortezomib, Dasatinib, IBET-762, Lorlatinib, Rapamycin) mit dem CellTiter-Glo Assay und der SynergyFinder Software. In der dualen Kombinationstherapie mit Panobinostat wirkten Doxorubicin, Temozolomid, Bortezomib, Dasatinib, Lorlatinib und Rapamycin synergistisch und erreichten eine Reduktion der metabolischen Aktivität von bis zu 95% in CLB-GA und GIME- N Neuroblastomzellen. Diese sechs Kombinationen wurden mit dem Caspase-Glo 3/7 Assay untersucht und die Daten mit einem Linear Mixed Effects Model ausgewertet. Alle Therapeutika außer Bortezomib wirkten synergistisch mit Panobinostat. Für die beiden besten Kombinationen, Panobinostat-Lorlatinib und Panobinostat-Rapamycin, untersuchten wir die PARP-Spaltung via Western blot und die Zellviabilität mittels Trypan Blau Färbungen. Die Daten wurden mit dem Mann-Whitney U Test ausgewertet. Die Kombination Panobinostat-Lorlatinib zeigte eine starke, synergistische Apoptose Induktion über ein breites klinisch relevantes Dosisspektrum. Diese Effekte bestätigten wir in sechs Neuroblastomzelllinien, die eine ALK p.R1275Q oder ALK p.F1174L Hotspot Mutation oder eine ALK Amplifikation tragen. Die metabolische Aktivität war in den ALK mutierten (LAN-5, Kelly, SK-NSH) um 82-99% und den ALK amplifizierten Zelllinien (IMR-5, IMR-32, NB-1) um 4 95-99% reduziert. Die Bliss Synergy Scores lagen zwischen 8.8-18.6 in ALK mutierten und 3.3-7.8 in ALK amplifizierten Neuroblastomzellen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Kombinationstherapie des Histondeacytelase Inhibitors Panobinostat mit dem ALK Inhibitor Lorlatinib wirksam gegen Neuroblastomzellen mit ALK Alterationen mit und ohne TERT Rearrangements ist und somit weitere in vivo Untersuchungen rechtfertigt.