Charakterisierung von Cytokininrezeptoren aus verschiedenen Organismen

Abstract

Cytokinine gehören zu einer Klasse von pflanzlichen Hormonen, die an vielen entwicklungsbiologischen und physiologischen Prozessen beteiligt sind. Das Cytokininsignaltransduktionssystem in Arabidopsis thaliana basiert auf dem Zwei-Komponenten-System (ZKS). Während die Cytokininsignaltransduktion in höheren Pflanzen gut erforscht ist, gibt es kaum Informationen über dieses System in früh divergierenden Landpflanzen und anderen Organismen (wie Bakterien und Algen). Um Einblicke in die Entstehung und Entwicklung des Cytokininregulierungssystems zu gewinnen, wurden wichtige Komponenten des Signalwegs dieses Phytohormons in den Genomen und EST-Daten von einer Vielzahl von verschiedenen Arten aus Bakterien und Algen bis zu modernen Landpflanzen identifiziert. Diese phylogenetische Analyse zeigte neben den klassischen Cytokininrezeptoren (Klasse C) eine neue Klasse von putativen Cytokininrezeptoren, die nur in den früh divergierenden Landpflanzen wie Marchantia polymorpha und Physcomitrella patens gefunden werden (Klasse B). Außerdem wurde eine dritte Klasse von Rezeptoren aus Cyanobakterien, Chlorophyceae Algen und Amöben nachgewiesen (Klasse A). Die Evolution der Cytokininrezeption wurde im Rahmen dieser Arbeit durch funktionelle Charakterisierung von putativen Cytokininrezeptoren aus verschiedenen Klassen (A, B und C) und Organismen in verschiedenen Systemen analysiert. Die biologische Funktion für drei Rezeptoren aus der Klasse A, Slr1759 aus Synechocystis sp. PCC 6803; CTK1 aus Chlamydomonas reinhardtii und acgA aus Dictyostelium discoideum, wurde charakterisiert. Eine sehr schwache spezifische Bindungsaktivität für das Cytokinin trans-Zeatin konnte für acgA und CTK1 in einem in vivo Cytokininbindungsassay beobachtet werden. Alle drei putativen Rezeptoren acgA, Slr1759 und CTK1 zeigten keine Aktivität in einem E. coli Komplementationsassay und konnten damit das Cytokininsignal auf die nächsten Mitglieder dieses E. coli Zwei-Komponenten-Systems nicht übertragen. Interessantweise konnten acgA und CTK1 das ZKS in der Arabidopsis Rezeptor- Mutantenlinie ahk2-5/ahk3-7 im Protoplasten-trans Aktivierungsassay (PTA) als Antwort für Cytokinin aktivieren. Der putative Rezeptor Slr1759 zeigte in diesem Assay eine hohe Aktivität, aber diese Aktivität war nicht von Cytokinin-abhängig. Zwei putative Cytokininrezeptoren aus der neuen Klasse (Klasse B), MpCHK1 aus Marchantia polymorpha und PpCHK4 aus Physcomitrella patens, wurden in dieser Arbeit funktionell als Cytokininrezeptor charakterisiert. Beide Rezeptoren zeigten eine Cytokininbindungsaktivität mit trans-Zeatin in einem in vivo Cytokininbindungsassay und konnten das ZKS spezifisch als Reaktion auf verschiedene Cytokinine mit verschiedenen Konzentrationen in einem bakteriellen Komplementationsassay in vivo aktivieren. Die Cytokininsignaltransduktion des atypischen Cytokininrezeptors CHARK aus Oryza sativa, der zur Klasse mit hohen konservierten CHASE Domäne Aminosäuren (Klasse C) gehört und außer der CHASE Domäne nur eine Serin/Threonin Domäne enthält, wurde im Rahmen dieser Arbeit auch charakterisiert. In einem in vivo Cytokininbindungsassay konnte für CHARK eine schwache spezifische Bindungsaktivität für das Cytokinin trans-Zeatin nachgewiesen werden. Er zeigte aber keine Aktivität in einem E. coli- Komplementationsassay, konnte aber interessantweise das ZKS in der Arabidopsis Rezeptor-Mutantenlinie ahk2-5/ahk3-7 im PTA mit einer hohen Cytokinin- Induktion aktivieren. Dieser putative Cytokininrezeptor zeigte auch in Arabidopsis Komplementationsanalysen in fünf von den sechs homozygoten Linien eine vollständige Komplementierung (Linie II-VI) der ahk2/ahk3 Mutanten. Zum besseren Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehung der diversen CHASE Domäne des PpCHK4 Rezeptors wurde die Lösung der räumlichen Struktur des Proteins angestrebt. Zu diesem Zweck wurde die CHASE Domäne mit verschiedenen N- oder C-terminalen Tags durch verschiedene Expressionsbedinungen und -Methoden in E. coli exprimiert. Die stärkste Expression der CHASE Domäne wurde mit dem MBP- Tag erreicht. Nach der Proteinaufreinigung lag das MBP-Protein nativ und in hoher Konzentration vor. Die Stabilität und die Kristallisationsbedingungen des Proteins wurden schließlich in verschiedenen Kristallisation-Screens überprüft. Eine Kristallisation der Domäne als eine notwendige Grundvoraussetzung für die Lösung der Tertiärstruktur Struktur war jedoch bis jetzt nicht erfolgreich.

Cytokinins are a class of plant hormones involved in many developmental and physiological processes. The cytokinin signal transduction is based on the two-component system (TCS). While the TCS of cytokinin signal transduction is well researched in higher plants, information about this system in early divergent land plants and other organisms (such as bacteria and algae) are rare. To gain insights into the origin and evolution of the cytokinin regulatory system, key components of the signaling pathway of this phytohormone were identified in the genomes and EST data of a wide variety of different species ranging from bacteria and algae to modern land plants. In addition to the clade of well known, “classical“ cytokinin receptors (clade C), this phylogenetic analysis revealed a new clade of putative cytokinin receptors, which contains only members from Marchantia polymorpha and Physcomitrella patens (clade B). Furthermore, a third clade was detected with receptors from cyanobacteria, chlorophyceae algae and amoebe (clade A). The evolution of cytokinin reception was analyzed in this work by functional characterization of putative cytokinin receptors from different clades (A, B and C) and organisms in different systems. The biological function of three receptors of the clade A, namely Slr1759 from Synechocystis sp. PCC 6803; CTK1 from the Chlamydomonas reinhardtii and acgA from Dictyostelium discoideum, was characterized. The in vivo cytokinin binding assay demonstrated a very weak cytokinin binding activity of acgA and CTK1 to trans-Zeatin. All three putative receptors, acgA, Slr1759 and CTK1, did not transduce the cytokinin signal into a cellular response in an E. coli complementation assay. Interestingly, acgA and CTK1 could activate the TCS in ahk2-5/ahk3-7 knockout mutants of A. thaliana in protoplasts trans-activation assay (PTA). The third putative receptor, histidine kinase receptor Slr1759 showed high activity in protoplasts transactivation assay (PTA), but this activity was not dependent on cytokinin. Two putative cytokinin receptors of the new clade (clade B), MpCHK1 from Marchantia polymorpha and PpCHK4 from Physcomitrella patens, were functionally characterized as cytokinin receptors in this work. Both receptors showed cytokinin binding activity with trans-Zeatin in an in vivo hormone binding assay and could specifically activate the TCS in response to various cytokinins with different concentrations in an E. coli complementation assay. All cytokinin receptors of the classical clade have a typical architecture with an N-terminal CHASE (Cyclase/Histidine-kinase-Associated Sensory Extracellular) domain, followed by a histidine kinase domain and a receiver domain. Except of the putative cytokinin receptor CHARK (CHASE domain Receptor-like serine/threonine Kinase) from Oryza sativa which has unusual domain architecture consisting of a CHASE domain and a serine/threonine kinase domain. To investigate, if CHARK uses an unusual pathway to transduce cytokinin in rice compared to the classical cytokinin receptors, the activity of this receptor was characterized using different assays. The in vivo hormone binding assay demonstrated a cytokinin binding activity for CHARK, but this putative receptor did not transduce the cytokinin signal into a cellular response in an E. coli complementation assay. Interestingly this receptor could activate the TCS in ahk2-5/ahk3-7 knockout mutants of A. thaliana in protoplasts trans-activation assay (PTA) with a high cytokinin induction. In Arabidopsis complementation assays the putative cytokinin receptor CHARK rescued also functionally the A. thaliana receptor mutated line ahk2/ahk3 plants, thus demonstrated this assay a full complementation of five from six homozygous lines (II-VI). For a better understanding of the evolution of cytokinin binding by the divergent CHASE domain of the putative cytokinin receptor PpCHK4, the crystallization and the solution of its tertiary structure was crucial. For this purpose the CHASE domain was expressed in E. coli with different N- or C-terminal tags through different experimental conditions and methods. The strongest expression of the CHASE domain has been reached with the MBP-tag. After the purification the MBP-CHASE was obtained in high concentration and purity. The stability and the crystallization conditions of the protein were finally checked in different crystallization screens. However, the crystallization of the CHASE domain as a necessary prerequisite for the solution of the tertiary structure was so far not successful.