Charakterisierung der calcium-abhängigen Proteinkinase CPK28 aus Arabidopsis thaliana als Regulator der Sprosselongation und der vaskulären Entwicklung

Abstract

Nach einer vegetativen Wachstumsphase vollziehen Pflanzen den reproduktiven Phasenwechsel, durch den bei Rosettenpflanzen wie Arabidopsis thaliana neben dem Blühen auch Elongation der Internodien und damit des Sprosses induziert wird. Diese Arbeit charakterisiert die calcium-anhängige Proteinkinase AtCPK28 als regulatorische Komponente, die die Sprosselongation und vaskuläre Entwicklung kontrolliert und damit spezifisch zur Pflanzenentwicklung nach dem Umschalten in die reproduktive Phase beiträgt. In zwei unabhängigen Mutanten- Allelen der cpk28 konnte, spezifisch nach dem Übergang in die reproduktive Phase, drastische Reduktion der Sprosselongation beobachtet werden, begleitet von der Verkürzung der Petiolen und Anthocyanakkumulation. Anatomische Analyse der basalen Sprossinternodien legte ein verändertes Muster der Sprossanatomie in cpk28 offen, charakterisiert durch Reduktion trachealer Xylemelemente und gleichzeitig verstärktem sekundärem Dickenwachstum mit ektopischer Lignifizierung. Übereinstimmend wurde in cpk28 erhöhte Expression von zellspezifischen Aktivatoren des sekundären Dickenwachstums im Spross beobachtet. Zusätzlich konnte ein Einfluss der CPK28-Funktion auf den Phytohormonstatus der Pflanze gezeigt werden. Der cpk28-Phänotyp konnte durch exogene Applikation von Gibberellinsäure (GA) partiell revertiert werden. Störungen im GA-Metabolismus wurden durch spezifisch in der reproduktiven Entwicklungsphase reduzierte Expression von Schlüsselenzymen der GA- Biosynthese in cpk28 bestätigt. Erste Analysen zum Zusammenhang zwischen CPK28 und dem Jasmonsäure-(JA)-Status der Pflanze lassen verstärkte JA- Signaltransduktion in cpk28 vermuten. Zum einen konnte erhöhte Expression von JA-Markergenen in cpk28 festgestellt werden, zum anderen wurde der cpk28-Sprosselongationsphänotyp in Doppelmutanten durch Aufhebung der JA- Biosynthese bzw. der JA-Signaltransduktion vollständig revertiert. Calcium- abhängige Kinaseaktivität der CPK28 konnte in vitro bestätigt werden. Außerdem führte Expression der aktiven Kinase im cpk28-Hintergrund zur vollständigen Reversion des Entwicklungsphänotyps, während Expression der inaktiven Kinase CPK28-D188A keine Veränderung bewirkte. Dies belegt die essentielle Rolle der CPK28 für die normale Pflanzenentwicklung. CPK28-Expression unter den gewebespezifischen Promotoren pSUC2 und pKNAT1, die Proteinexpression in anderen Geweben vermitteln als in dieser Arbeit für den CPK28-Promoter gezeigt, war ebenfalls ausreichend für die vollständige Komplementation des cpk28-Phänotyps. Dies lässt vermuten, dass mit Hilfe der CPK28-Aktivität möglicherweise ein mobiles Signal zur Sprosselongation generiert oder weitervermittelt wird. Weiterhin konnte in vivo-Autophosphorylierung der CPK28 an drei Phosphorylierungs-stellen gezeigt werden. Austausch der jeweiligen Aminosäuren führte für zwei der drei untersuchten Stellen zu reduzierter, weiterhin calcium-abhängiger Kinaseaktivität in vitro. Allerdings konnte unabhängig von der in vitro-Aktivität für jede der untersuchten Phosphorylierungsvarianten Komplementation der morphologischen Defekte von cpk28 in vivo beobachtet werden. AtCPK28 als Regulator der koordinierten Sprosselongation und des sekundären Dickenwachstums stellt damit eines der wenigen Beispiele dar, das Calcium-Signaltransduktion mittels CDPKs direkt mit einem wichtigen, stadienspezifischen Entwicklungsprozess in Verbindung bringt.

After a period of vegetative growth plants undergo a developmental switch to the reproductive phase, inducing flowering and, in plants with a rosette habit like Arabidopsis thaliana, the transition to bolting and elongation of the inflorescence stem. This work identified the calcium-dependent protein kinase AtCPK28 as a regulatory component controlling stem elongation and vascular development, specifically contributing to plant development after this switch to the generative phase. In two independent mutant alleles of cpk28, a severe reduction of stem elongation, accompanied by shorter leaf petioles and enhanced anthocyanin levels, was observed upon the transition to the reproductive phase. Anatomical analysis of the basal internode of the stem revealed an altered vascular pattern in cpk28, characterised by fewer xylem tracheary elements and increased secondary growth and ectopic lignification. Coincident, cpk28 mutants showed enhanced expression of cell type-specific key activators of secondary growth in the stem. Additionally, an impact of CPK28 function on the phytohormone status of the plant was demonstrated. The cpk28 phenotype was partially reverted by exogenous application of gibberellic acid (GA). Disturbances in GA metabolism were confirmed by transcriptional repression of key regulators of GA homeostasis in cpk28, specifically at later stages of plant development. First analyses of the influence of CPK28 on the jasmonic acid (JA) status indicate increased JA signalling in cpk28, since expression of JA marker genes was enhanced in cpk28 and its shoot elongation phenotype could be fully reverted in double mutants blocking JA synthesis or JA signalling. In vitro protein kinase activity of CPK28 was demonstrated to be strictly calcium-dependent. Expression of active kinase in the cpk28 background led to a complete restoration of the phenotype while inactive protein CPK28-D188A did not, proving the essential role of CPK28 for plant development. CPK28 expression under the tissue specific promoters pSUC2 and pKNAT1, driving protein expression in defined tissues different from the expression pattern conferred by the CPK28 promoter, was also sufficient for complementation of the phenotype. This might be due to a mobile signal generated or propagated with the help of CPK28 activity. Furthermore, CPK28 was phosphorylated in vivo at several sites. Site-specific amino acid substitutions at two of the three phosphorylation sites resulted in reduced in vitro activity. However, when introduced into a cpk28 mutant background, all phosphorylation site variants complemented the morphological and developmental defects. AtCPK28 as a regulator for coordinated stem elongation and secondary growth represents one of the few examples directly linking calcium signalling via CDPKs to an important stage-specific developmental process.