Struktur-Funktionsanalyse der Polycomb Gruppen Proteine Psc, Su(z)2 aus Drosophila und Bmi-1 aus Maus

Abstract

Polycomb Gruppen (PcG) Proteine sind epigenetische Regulatoren der Entwicklung von Drosophila und anderer Organismen. Sie binden spezifische Chromatinregionen und bewirken durch lokale biochemische Modifikationen der Histonproteine und Veränderung der Chromatinstruktur die dauerhafte Stummschaltung ihrer Zielgene. Das Drosophila PcG Protein Posterior sex combs (Psc) wurde als Kernkomponente von repressiven PcG-Multiproteinkomplexen (PRC-1, dRAF-RC) charakterisiert, allerdings ist die genaue Funktion, möglicherweise bei nicht-kovalenten Chromatinmodifikationen und/oder als Verstärker einer H2A-spezifischen E3 Ubiquitin Ligase Aktivität noch unzureichend verstanden. In vitro Studien zeigten, dass die carboxyterminale Region (CTR) Chromatin kompaktieren, und das für die Transkription notwendige Chromatin Remodeling verhindern kann. Die CTR ist im paralogen PcG Protein Suppressor of zeste 2 (Su(z)2) zwar nicht in der Primäresequenz, aber in Bezug auf die ungewöhnliche Aminosäurekomposition und Ladungsverteilung in ähnlicher Weise vorhanden. Dementsprechend können alle in vitro Funktionen gleichermaßen von Su(z)2, bzw. auch der Su(z)2-CTR alleine ausgeübt werden. Auch das Su(z)2 Protein wurde in einem PRC1-ähnlichen Multiproteinkomplex aufgereinigt, in dem es Psc ersetzt. Im Gegensatz zu früheren Befunden zeige ich eine nahezu vollständige Kolokalisation beider Proteine in Immunfärbungen an Polytänchromosomen. Entsprechend wurde mit genetischen Methoden bislang die Wirkung beider essentieller Gene als partiell redundant beschrieben. Durch die Analyse von Su(z)2 Funktionsverlustphänotypen zeige ich in meiner Arbeit eigenständige Funktionen von Su(z)2, insbesondere in der Zellzykluskontrolle, die den doppelmutanten Phänotyp stark ähneln. Somit wird klar, dass Su(z)2 neben der redundanten Funktion mit Psc bei der Repression von Zielgenen, auch eigenständige Funktionen in der späten Entwicklung - beispielsweise die Kontrolle des Zellzyklus - besitzt, die nicht durch Psc ersetzt werden können. Das späte Auftreten dieser Defekte und Beobachtung in Immunfärbungen deuten auf die Stabilität des Su(z)2 Proteins. In Säugern finden sich zwei strukturell verwandte und ebenfalls partiell redundant wirkende PcG Faktoren, Bmi-1 und Mel-18. Diese spielen bei der Tumorgenese eine wichtige Rolle und Bmi-1 ist zudem für die Aufrechterhaltung verschiedener somatischer Stammzellpopulationen notwendig. Alle vier Fliegen- und Säugerproteine enthalten jeweils eine etwa 200 Aminosäuren umfassenden Homology Region (HR), die sehr gut konserviert ist und für die spezifische Chromatinbindung ausreichend und notwendig ist. Um die molekulare Funktion genauer zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine detaillierte Funktions-Struktur- Analyse von Psc, Su(z)2 und Bmi-1 in einem transgenen in vivo Ansatz durchgeführt. Die verschiedenen Konstrukte beider Fliegengene verhalten sich sehr ähnlich, so dass drei funktionelle Bereiche unterschieden werden können: neben der HR, die als Anker bei der Chromatinlokalisation wirkt, lässt sich innerhalb der CTR jeweils ein für die Funktion notwendiger Bereich – CTR1 – und eine Vertärkerregion – CTR2 – unterscheiden. In Übereinstimmung mit der Kartierung der dominanten Funktion in den CTR1-Bereichen sind die RING-Finger Motive weder für die Chromatinbindung noch für die getestete dominante Funktion notwendig. Dies steht im Gegensatz zu der Funktionsweise des Säuger Bmi-1 Proteins, dass in unserem transgenen Testsystem nur einige Aspekte der Su(z)2- und Psc-Funktion teilt. So zeigt Bmi-1 spezifische Chromatinlokalisation in endogenen Psc Bindestellen und die Wirkung der isolierten HR ist ebenso wie bei Su(z)2 und Psc dominant-negativ. Das deutet darauf hin, dass Sequenzen, die die Interaktion mit anderen PcG Faktoren vermitteln, evolutionär konserviert sind und mutmaßlich die Bindung im Komplex ausreichend ist, um endogenes Su(z)2 und Psc auszutitrieren. Allerdings zeigt Bmi-1 keine dominante Repression von engrailed. In Säugerzellen ist interessanterweise das RING-Finger Motiv und nicht die CTR für die dominante Funktion notwendig, wodurch unterschiedliche Wirkmechanismen zwischen Fliegen Su(z)2 und Psc und Säuger Bmi-1 weiterhin verdeutlicht werden.

Polycomb group (PcG) proteins function as epigenetic regulators of development in Drosophila and other organisms. They target specific chromatin regions and permanently silence the associated genes by local biochemical modifications of the histone proteins and by alterations of the chromatin structure. The Drosophila Posterior Sex Combs (Psc) protein has been identified as a core component of repressive PcG multi-protein complexes (PRC-1, dRAF-RC). Yet, its molecular function is not completely understood. It is believed to enhance the histone H2A-specific E3 ubiqutin ligation function and/or contribute to non- covalent histone modifications. In vitro studies demonstrated that the carboxyterminal region (CTR) is competent to compact chromatin and inhibit chromatin remodeling. The paralogous PcG protein Suppressor of zeste 2 (Su(z)2) contains a similar CTR that resembles the Psc CTR in respect of its unusual amino acid composition and arrangement of clusters of positive charge but not in primary sequence. Accordingly, the Su(z)2 protein or its CTR alone are competent to perform all in vitro functions. Su(z)2 has been identified as a component of a PRC1-like complex where it replaces Psc. In contrast to previous reports I show a close to complete co-localization of Psc and Su(z)2 on polytene chromosmes. In good agreement with this observation genetic analysis point at a partial redundant function of these two genes. However, my analysis of Su(z)2 loss of function mutant phenotypes uncovers unique Su(z)2 functions that closely resemble the double mutant Su(z)2/Psc mutant phenotype, expecially in respect to cell cycle control. Thus, in addition to its redundant function with Psc in the repression of target genes Su(z)2 exerts unique functions in late development, e.g. cell cycle control. These latter functions cannot be compensated for by Psc. Together, the fact that Su(z)2 phenotypes occur late in development and observations from immun-stainings suggest that the Su(z)2 protein is stable. Mammals have two structurally related PcG proteins, Bmi-1 and Mel-18, that likewise show partial redundant function. Both are implicated in tumorigenesis and additionally Bmi-1 is required for the maintenance of different somatic stem cell populations. All four fly and mammalian proteins share a well conserved homology region (HR) of app. 200 amino acid residues that is necessary and sufficient for specific chromatin binding. In order to further analyse the molecular mechanisms I conducted a detailed structure-to-function analysis of Psc, Su(z)2 and mouse Bmi-1 following a transgenic in vivo approach. The different constructs of the two fly proteins behaved similar and uncovered three functional sections: the HR that serves as an anchor to recruit the protein to specific chromatin sites, and two areas within the carboxy-terminal region (CTR); CTR1 that is necessary for the dominant function and CTR2 that acts as an enhancer for these dominant functions. Consisten with the mapping of the dominant function to the CTR the RING-finger motiv seems to be dispensable for the tested dominant functions. This mode of action contrasts the mechanism of mammalian Bmi-1 that recapitulates only some aspects of the fly protein in our transgenic system. Bmi-1 binds to specific chromatin positions that also recruit Psc protein and the isolated HR also shows dominant-negative activity. This suggests that sequences for the interaction with other PcG proteins and incorporation in the multi-protein complexes are evolutionary conserved. This binding activity appears to be sufficient to compete out endogenous Su(z)2 and Psc. However, transgenic Bmi-1 is not sufficient to dominantly suppress engrailed. In mammalian cells the RING-finger motiv of Bmi-1 and not the CTR is necessary for dominant functions exemplifying differences in the mode of action between mammalian Bmi-1 and Su(z)2 and Psc from the fly.