Immunoproteasom und Proteasomaktivator 28 als Marker in der Diagnostik von Autoimmun- und Tumorerkrankungen

Abstract

Der multikatalytische Proteasomkomplex und das induzierbare Immunoproteasom sind für den Abbau einer Vielzahl zellulärer Proteine zuständig und spielen eine entscheidende Rolle in Zellzyklus, Antigenpräsentation und Apoptose. Aus diesem Grund steigt auch das Interesse an proteasomalen Proteinen und assoziierten Aktivatoren als Marker in der Diagnostik oder bei der Aufklärung grundlegender Biomechanismen. Besonders der Proteasomenaktivator 28 gamma (PA28) wurde bereits mit Autoimmun- und Tumorerkrankungen sowie mit p53-vermittelten Apoptoseprozessen in Verbindung gebracht, wobei sowohl von erhöhten Serumkonzentrationen als auch Autoantikörpern gegen PA28berichtet wurde. Ziel der Arbeit war es daher, die Relevanz von PA28als Biomarker zu untersuchen, geeignete Tests zur Serumlevel- und Antikörperepitop-Bestimmung zu generieren und grundlegende Einflüsse von PA28auf das Apoptoseverhalten in vitro zu untersuchen. Um PA28-Serumlevel von Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen zu bestimmen, wurde ein neuartiger quantitativer Sandwich-ELISA entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass PA28 keinen krankheitsspezifischen Biomarker darstellt, jedoch mit der Krankheitsaktivität bei RA-Patienten korreliert. Somit kandidiert PA28 als neuer, vielversprechender Verlaufsmarker in der Behandlung der RA. Mit einem neuartigen Mikrobead-Assay im Multiplex-Format war es möglich, spezifische Epitope von zu untersuchenden PA28-Antikörpern zu detektieren. Dieser Test kann sowohl in Diagnostik als auch bei der Grundlagenforschung Anwendung finden. Die Untersuchung der antiapoptotischen Wirkung von PA28 erfolgte mit Hilfe PA28-überexprimierender muriner Fibroblasten (B8) sowie HT29-Darmkrebzellen, deren PA28-Level mittels miRNA-Knockdown minimiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass PA28 einen großen Einfluss auf eine Vielzahl von Apotosemarkern hat. Insbesondere werden, obwohl PA28 selbst Substrat der Caspase ist, bei einer Überexpression die Caspaseaktivitäten vermindert und bei einem Knockdown gesteigert, was für eine gegenseitige Beeinflussung spricht. Außerdem führt eine Überexpression von PA28 zu einer Akkumulation von transkriptionell aktiven phosphoryliertem p53 im Nukleus. Die weitreichenden antiapoptotischen Effekte von PA28 sowie der Einsatz als Biomarker im Krankheitsverlauf bedürfen weiter führender Untersuchungen. Dies könnte letztendlich zur Aufklärung von Bioprozessen im Krankheitsfall sowie der Therapie von Tumor- und Autoimmunerkrankungen beitragen.

The multicatalytic proteasome complex and the inducible immunoproteasome are essential for the degradation of a various number of cellular proteins and play a crucial role in cell cycle, antigen presentation and apoptosis. Thus, the interest on proteasomal proteins and associated activators as a marker in diagnostics or in enlightenment of rudimental bio-mechanisms remains unrefracted. Especially, protesome activator 28 gamma (PA28) was connected to autoimmune and tumor disorders and also to p53 mediated apoptotic processes, in which high PA28 serum levels as well as autoantibodies have been reported. The aim of this study was to estimate the relevance of PA28 as biomarker, to develop useful assays for determination of serum levels and antibody epitope detection and to study rudimental influences of PA28 on apoptotic behavior in vitro. To evaluate PA28 serum levels in patients with different disorders, a novel quantitative sandwich ELISA was developed. Although the application of this assay for diagnostic purposes of specific diseases remains limited, the correlation with disease activity in patients with RA suggests a prognostic value. Therefore, PA28 applies as novel marker for disease activity especially in treatment studies. The detection of specific epitopes recognized by relevant PA28 antibodies was performed by a novel multiplex assay using microbead technology. This assay could be useful in diagnostics as well as basic research. Anti-apoptotic effects of PA28 were investigated by using PA28-overexpressing murine fibroblasts (B8) and PA28-silenced HT29 adenocarcinoma cells. The findings indicated that PA28 has a strong influence on different apoptotic hallmarks. Although PA28 itself is a substrate of caspases, overexpression of PA28 leads to a decrease of caspase activity and vice versa knockdown results in an increase. Thus, PA28 and effector caspases mutually restrict each other. Furthermore, an overexpression of PA28 leads to an accumulation of transcriptional active phosphorylated p53 in the nucleus. The extensive anti-apoptotic effects of PA28 as well as the application as biomarker for disease activity requires further studies. In summary, this could lead to an enlightment of disease processes and contribute therapeutical targets of autoimmune and tumor disorders.