Genexpressionsmuster von Prestin und ausgewählten Transkriptionsfaktoren im Cortischen Organ postnataler Ratten

Abstract

Prestin ist das Motorprotein der äußeren Haarzellen im Cortischen Organ des Innenohres. Durch seine mechanosensorische Kopplung ist es maßgeblich für die hohe Sensitivität des Hörens verantwortlich. Die molekularen Mechanismen der Expressionsregulation von Prestin werden immer noch unzureichend verstanden. In dieser Arbeit wurde die mRNA-Expression von Prestin und die der Transkriptionsfaktoren Pou4f3 (POU domain, class 4, transcription factor 3), C/ebpβ (CCAAT/enhancer binding protein beta), Sp1 (specificity protein 1), Carf (calcium response factor) und Creb1 (cAMP response element binding protein) bei Ratten mittels Echtzeit-PCR unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen bestimmt und auf zwei Bezugssysteme bezogen. Hierfür dienten der totale RNA-Gehalt einer Probe und der mRNA-Gehalt des Haushaltsgens Tbp. Die Expression von Prestin und die der ausgewählten Transkriptionsfaktoren wurden verglichen hinsichtlich: 1.) des Musters der Expression, 2.) der Korrelation des mRNA-Gehalts und 3.) der Existenz von Bindungsstellen für die untersuchten Transkriptionsfaktoren in den Promotorbereichen von Prestin und der Transkriptionsfakoren. Es wurden Bedingungen gewählt, von denen bekannt ist, dass sie einen Einfluss auf die Expression von Prestin haben. Dies sind zum einen die Expressionsveränderungen während der postnatalen Entwicklung der Ratte zwischen dem 2. und dem 8. postnatalen Tag. Zum anderen wurden Expressionsveränderungen in der organotypischen Kultur des Cortischen Organs gezielt induziert. Hierzu wurden der Kultur Thyroxin (T4), Kaliumchlorid (KCl), Natriumbutyrat (NB) bzw. Retinsäure (RS) in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Außerdem erfolgte die Suche nach Expressionsveränderungen entlang der apikal-basalen Achse des Cortischen Organs. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die mRNA–Expressionen von Prestin und Pou4f3 in der postnatalen Entwicklung sowie in der organotypischen Kultur unter Zugabe von Thyroxin (0,5 µM), Natriumbutyrat (bis 2000 µM) und erhöhter KCl-Konzentration (50 mM) signifikant miteinander korrelieren. Beide Gene bilden außerdem sowohl in der postnatalen Entwicklung als auch in der 48h-Kultur unter Zugabe von Thyroxin (0,5 mM) einen apikal- basalen Gradienten entlang der apikal-basalen Achse des Cortischen Organs aus. Für C/ebpβ und Prestin zeigte sich in der postnatalen Entwicklung und in den 48h-Kulturen unter Zugabe von Thyroxin (0,5 mM) sowie Retinsäure (bis 100 µM) eine signifikante Korrelation zwischen der Expression beider Gene. Auch C/ebpβ bildet in der postnatalen Entwicklung einen apikal-basalen Gradienten im Cortischen Organ aus. Die Expression des Transkriptionsfaktors Carf korreliert mit der Prestinexpression sowohl in der Kultur unter Zugabe von Thyroxin (0,5 mM) als auch unter Zugabe von KCl (50 mM). Für die Faktoren Sp1 und Creb1a sind keine signifikanten Korrelationen nachweisbar. Mithilfe einer modifizierten Präparationsmethode wurde analysiert, inwieweit im Innenohr eine unterschiedliche Expression der untersuchten Transkriptionsfaktoren im Bereich der Haarzellen und der angrenzenden Limbusregion vorliegt. Dabei zeigte sich, dass die Transkriptionsfaktoren Gata3 und C/ebpβ im Cortischen Organ höher exprimiert werden als im Limbus. Für Pou4f3 ist eine spezifische Expression in den äußeren Haarzellen des Cortischen Organ bekannt. Für Sp1, Carf und Creb konnte keine höhere Expression im Cortischen Organ gefunden werden. In einer in silico-Analyse der Promotorregionen von Prestin bei Mensch, Ratte, Maus und Rind fanden sich Hinweise darauf, dass homologe Bindungsstellen für Pou4f3, C/ebpβ und Carf in der Promotorregion von Prestin zu finden sind. Auch Bindungsstellen für Retinsäure und Thyroxin finden sich häufiger in den Promotorsequenzen von Prestin als in zufälligen Sequenzen gleicher Basenzusammensetzung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Transkriptionsfaktoren Pou4f3, C/ebpβ und Carf an der Regulation der Expression von Prestin beteiligt sein können. Es bedarf weiterer experimenteller Untersuchungen, um die funktionelle Relevanz der Transkriptionsfaktoren und Bindungsstellen zu beweisen.

Prestin, the motor protein of the outer hair cells in the organ of Corti in the inner ear, plays a crucial role in the sensitivity of hearing due to its role in mechano-sensoric transduction. Up to today, the molecular regulatory mechanisms of prestin expression are still not completely understood. In this study, mRNA expression of prestin and the transcription factors Pou4f3 (POU domain, class 4, transcription factor 3), C/ebpβ (CCAAT/enhancer binding protein beta), Sp1 (specificity protein 1), Carf (calcium response factor) and Creb1 (cAMP response element binding protein) in rats were measured with the help of Real-Time-PCR, applying different experimental conditions, and referring to two reference systems. The total concentration of RNA in one sample and the concentration of mRNA of the housekeeping gene Tbp were used as independent reference systems. The expression of prestin and the transcription factors investigated in this study were compared for: 1. the pattern of expression; 2. the correlation between mRNA concentrations; and 3. the existence of binding sites for the selected transcription factors in promoter regions of prestin and of the transcription factors. The chosen conditions in this study are known to have an impact on the expression of prestin. These are firstly the changes during postnatal development in rats between the 2nd and 8th day. Secondly, expression changes were induced specifically in the organotypic culture of the organ of Corti. For this purpose, the culture was modified by adding thyroxin (T4), potassium chloride (KCl), and sodium butyrate (SB), or retinoic acid (RA) respectively, in various concentrations. In addition, the search was done for expression changes along the apical-basal axis of the organ of Corti. This work shows the significant correlation between mRNA expression of prestin and Pou4f in the postnatal development and furthermore in the organotypic culture with the addition of thyroxin (0.5 µM), sodium butyrate (up to 2000 µM), and increased potassium chloride (KCl) concentrations (50 mM). Furthermore, both genes show an apical-basal gradient along the apical-basal axis of the organ of Corti in the postnatal development as well as in the 48h culture with the addition of thyroxin (0.5 mM). Another significant correlation was demonstrated between the expression of C/ebp and prestin in the postnatal development and in the 48h culture after adding thyroxin (0.5 mM) and retinoic acid (up to 100 µM). In addition to that, C/ebp also shows an apical-basal gradient in the organ of Corti in the postnatal development. The expression of the transcription factor Carf correlates with the prestin expression in the organotypic culture with the addition of thyroxin (0.5 mM) as well as under the condition of applying KCL (50 mM). There were no significant correlations between prestin expression and the transcription factors Sp1 or Creb1a. Using a modified method of preparation, an analysis was performed concerning local differences in the expression of transcription factors in the inner ear between the area of hair cells and the modiolus. It was found that the transcription factors Gata3 and C/ebpβ are higher expressed in the organ of Corti than in the limbus. Pou4f3 is already known to be expressed specifically in the external hair cells of the organ of Corti. Compared to the modiolus, the expression of the transcription factors Sp1, Carf, and Creb is not increased in the organ of Corti. An in silico analysis of the promoter regions of prestin in human, rat, mouse, and bovine provided evidence for the existence of homologous binding sites for Pou4f3, C/ebpβ, and Carf in these regions. In addition to that, binding sites for retinoic acid and thyroxin are found more frequently in the promoter sequences of prestin rather than in random sequences with identical base composition. These results indicate that the transcription factors Pou4f3, C/ebpβ and Carf are potential candidates for the regulation of prestin expression. Further experimental studies have to be performed to prove the functional relevance of these transcription factors and their binding sites.