Gene Expression Changes in the Course of Neural Progenitor Cell Differentiation

Abstract

Neural progenitor cells exist in the central nervous system of rodents and primates, and divide throughout life. They reside in the subventricular zone and generate neurons, which migrate to the olfactory bulb, where they integrate functionally as interneurons. Under appropriate conditions, the progenitor cells proliferate in vitro and form free-floating clusters, called neurospheres, that are composed of dividing progenitors and early differentiating cells. Neurospheres represent an in vitro model system for the analysis of adult neurogenesis. Neural progenitors from mice were cultivated and differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. To shed more light on the molecular mechanisms governing the proliferation of neural progenitors and their migration and differentiation into specific cell types, dynamic gene expression changes during the first four days of neurosphere differentiation were measured with cDNA microarrays containing 13,627 clones. To identify genes with key regulatory functions, a time course study was done in which proliferating progenitors were compared to cells that had differentiated for 24, 48, or 96 hours. A cluster analysis revealed the dynamics of gene expression changes during the time course and identified groups of genes with a similar onset and course of transcriptional changes. Following literature studies and protein domain predictions, these genes were sorted into ten categories according to their function or cellular localization. This study revealed many new interesting genes that change in expression in the course of neural progenitor cell differentiation. These genes are potentially relevant for adult neurogenesis. Differential expression of selected genes was confirmed by semi-quantitative RT-PCR. Immunofluorescence experiments on differentiating neurosphere cells demonstrated selected corresponding proteins in specific cell types. These findings correlated with the in situ situation in the subventricular zone, as was shown by immunohistofluorescence studies of adult mouse brain sections. Some very interesting candidate genes, their expression, and their potential functional involvement in the maintenance of progenitor cells and in the migration and differentiation of new neurons were discussed. Results from the microarray and immunofluorescence experiments support the proposed lineage relationship of embryonic radial glial cells and adult subventricular zone progenitor cells. Among the differentially expressed genes were Ptpns1 and Cd47, whose products constitute a cell-cell communication system involved in cellular recognition, aggregation, and migration. First experiments aiming at the functional characterization of PTPNS1 and CD47 in the context of neuroblast migration were described.

Neurale Vorläuferzellen, welche sich lebenslang erneuern, existieren in der Subventrikularzone des zentralen Nervensystem von erwachsenen Nagern und Primaten. Aus diese Zellen entstehen Neurone, welche zum Bulbus olfactorius migrieren und dort als Interneurone integrieren. Durch Proliferation in vitro gehen aus diesen Vorläuferzellen rundliche Zellaggregate, sogenannte Neurosphären hervor, welche sich aus teilenden Vorläufern und differenzierenden Zellen zusammensetzen. Neurosphären sind ein Modellsystem für in vitro Studien zur adulten Neurogenese. Murine neurale Vorläuferzellen wurden kultiviert und in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenziert. Da die Proliferation der Vorläuferzellen sowie deren Differenzierung und Migration auf molekularer Ebene weitgehend unverstanden sind, wurden dynamische Genexpressionsveränderungen während der in vitro- Differenzierung von Neurosphärenzellen mit cDNA-Microarrays untersucht. Um Gene zu identifizieren, welche für den Übergang von Vorläuferzellen in differentierte Zellen wichtig sind, wurden proliferierende Zellen mit Zellen 24, 48 oder 96 Stunden nach Induktion der Differenzierung verglichen. Somit konnte für jeden der fast 14.000 Klone auf dem Microarray ein Zeitverlauf der Genexpressionsveränderungen während der ersten vier Tage der Differenzierung ermittelt werden. Eine Clusteranalyse identifizierte Gruppen von Genen mit vergleichbarem Beginn und Verlauf der Genexpressionsänderungen während des Experiments. Durch Literaturstudien und Proteinstrukturanalysen ihrer Produkte wurden diese Gene anhand ihrer Funktion oder zellulären Lokalisation in zehn Kategorien sortiert. Auf diese Weise wurden viele neue und interessante Kandidatengene gefunden, welche möglicherweise zur adulten Neurogenese beitragen. Die differentielle Expression einiger Gene wurde mittels semi- quantitativer RT-PCR bestätigt. Eine zelltypspezifische Expression ausgewählter Gene konnte durch Detektion der kodierten Proteine gezeigt werden. Mittels Immunhistofluoreszenzexperimenten wurden diese Proteine in der Subventrikularzone adulter Mäuse nachgewiesen. Die Expression einiger sehr interessanter Kandidatengene sowie deren potentielle Funktion in den Vorläuferzellen und während der Migration und Differenzierung der neuen Neurone wurden diskutiert. Die adulten murinen Vorläuferzellen der Subventrikularzone stammen vermutlich von embryonalen radialen Gliazellen ab und die vorliegenden Resultate der Microarray-Analysen und der Immunfluoreszenzexperimente stützen diese Theorie. Unter den differentiell exprimierten Genen fanden sich Ptpns1 und Cd47. Deren Produkte fungieren bei der zellulären Erkennung, Aggregation und Migration als Zell-Zell- Kommunikationssystem. Erste Experimente zur funktionellen Charakterisierung von PTPNS1 und CD47 während der Neuroblastenmigration wurden durchgeführt und diskutiert.