NMN-Adenylyltransferase und NAD+-Kinase: essentielle Enzyme der NAD(P)+-Synthese

Abstract

Die beiden Nukleotide NAD+ und NADP+ sind essentielle Coenzyme für zahlreiche Redoxreaktionen in allen bekannten Organismen. Sie sind außerdem Vorstufen für Signalmoleküle und Substrate für kovalente Proteinmodifikationen in höheren Eukaryoten. Bislang lagen zu den essentiellen Enzymen der NAD(P)+-Synthese, der NMNAT und der NAD+-Kinase, keine Sequenzdaten vor. Aus diesem Grund waren molekular- und zellbiologische Untersuchungen der NAD(P)+-Synthese und deren Regulation bisher nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden die Voraussetzungen für solche Untersuchungen geschaffen und erstmals proteinchemische und zellbiologische Studien dieser Proteine durchgeführt. Die cDNA-Sequenz der humanen NAD+-Kinase wurde identifiziert. Das Protein wurde in E. coli überexprimiert und gereinigt. Es wurden Antikörper generiert, mit deren Hilfe endogene NAD+-Kinase in humanen Zellen nachgewiesen wurde. Darüber hinaus wurde das Enzym im Cytosol von transfizierten humanen Zellen lokalisiert. Humane NAD+-Kinase hat eine molekulare Masse von etwa 50 kDa. Sie bildet ein katalytisch aktives Homotetramer, wie durch Gelfiltrationsexperimente gezeigt werden konnte. Das Enzym weist eine hohe Substratspezifität auf, eine Phosphorylierung verschiedener NAD+-Analoga, darunter NAAD+, konnte nicht beobachtet werden. Die hier klonierte NAD+-Kinase kommt daher wahrscheinlich nicht, wie eingangs vermutet, für eine Synthese des Calcium-Mediators NAADP+ in Frage. Die mRNA der NAD+-Kinase konnte in zahlreichen humanen Geweben mit Ausnahme von Muskelzellen nachgewiesen werden. Durch einen Vergleich der cDNA-Sequenz mit genomischen Sequenzen und durch eine Southern Blot-Analyse konnte das Gen der NAD+-Kinase auf Chromosom 1 lokalisiert werden. Die Proteinsequenz der humanen NAD+-Kinase wurde mit den inzwischen klonierten NAD+-Kinasen aus M. tuberculosis, E. coli und S. cervisiae verglichen, wobei 38 konservierte Reste identifiziert wurden. Diese liegen innerhalb einer konservierten Proteindomäne, die in etwa 100 bislang uncharakterisierten Proteinen zahlreicher Organismen, darunter auch in einem weiteren humanen Protein, vorkommt. Möglicherweise handelt es sich hierbei um eine zweite humane NAD+-Kinase. Die humane NMNAT wurde ebenfalls in E. coli überexprimiert. Gegen das gereinigte rekombinante Protein wurden Antikörper generiert, die eine Lokalisierung des endogenen Proteins in den Kernen humaner Zellen erlaubten. Es konnte eine Phosphorylierung der NMNAT in vitro und in vivo detektiert werden. Eine Phosphorylierungsstelle wurde durch massenspektrometrische Analyse identifiziert und konnte durch Mutagenese- Studien bestätigt werden. Es handelt sich um das Serin 136, das sich in unmittelbarer Nähe der NLS in einem strukturell exponierten Bereich der NMNAT befindet. Das Serin 136 liegt innerhalb einer Konsensussequenz welche die Modifikation durch Proteinkinase C nahelegt. Der Einfluß von Effektoren der Proteinkinase C, PMA und BIM, auf die Phosphorylierung der NMNAT in vitro und in vivo weisen ebenfalls auf eine Phosphorylierung durch diese Kinase hin. Die Funktion dieser Modifikation ist nicht bekannt. Die katalytische Aktivität der NMNAT, die Kernlokalisation des Enzyms sowie seine Wechselwirkung mit PARP-1 blieben davon unbeeinflusst. Zusammengefaßt stellen diese Ergebnisse für das Verständnis der NAD(P)+-Synthese und der daran gekoppelten zellulären Energie- und Signalprozesse einen großen Fortschritt dar. Erstmalig sind Schlüsselenzyme der NAD(P)+-Synthese eukaryotischer Zellen für Untersuchungen in vivo und in vitro zugänglich geworden.

The pyridine nucleotides NAD+ and NADP+ are essential coenzymes in numerous redox reactions in all known organisms. Moreover, NAD+ and NADP+ are precursors of signal molecules and substrates for covalent protein modifications in higher eukaryotes. When this study was started no molecular data for the essential enzymes of NAD(P)+-synthesis, namely NMNAT and NAD+-kinase were available. Therefore, molecular and cell biological analyses of NAD(P)+ synthesis and its regulation had not been possible. In this study, for the first time a proteinchemical and cell biological examination of these two proteins was conducted. The cDNA-sequence of the human NAD+-kinase was identified. The protein was overexpressed in E. coli. The purified enzyme was used to generate antibodies that enabled to the detection of the endogenous NAD+-kinase in human cells. The enzyme was localised in the cytosol of transfected human cells. Human NAD+-kinase exibits a molecular mass of approximately 50 kDa and forms a catalytically active homotetramer as demonstrated by gelfiltration experiments. The enzyme is highly specific for its substrates ATP and NAD+. No phosphorylation of different NAD+-analogues, among others NAAD+, was observed. Therefore, the NAD+-kinase that was cloned during this study does nor appear to catalyse the synthesis of the calcium releasing agent NAADP+. The mRNA encoding NAD+-kinase was detected in numerous human tissues except muscle. Comparison of the cDNA sequence with genomic sequences and a southern blot analysis led to the localisation of the NAD+-kinase gene on chromosom 1. The protein sequence of human NAD+-kinase was compared with other NAD+-kinases that had been cloned from M. tuberculosis, E. coli and S. cervisiae. 38 conserved residues were identified. These residues are located within a conserved protein domain which has been detected in approximately one hundred so far uncharacterised proteins of different organisms. Among others, there was another human protein containing this domain. This protein potentially represents a second human NAD+-kinase. The human NMNAT was also overexpressed in E. coli. The purified protein was used to generate antibodies that permitted the visualisation of the enzyme exclusively in nuclei of human cells. The primary structure of NMNAT indicated the presence of potential phosphorylation sites. Indeed a phosphorylation of NMNAT in vitro and in vivo was detected. A phosphorylation site, Serin 136, was identified by mass spectrometric analyses and was confirmed by mutagenesis studies. This Serin is located in close proximity to the NLS in a surface area of the protein. Serin 136 is part of a consensus sequence that indicates modification by protein kinase C. The influence of the two protein kinase C effectors PMA and BIM on this modification in vitro and in vivo also supported a phosphorylation by this kinase. The function of the modification is not known yet. No influence on the catalytic activity of NMNAT, the nuclear localisation of the enzyme nor on the interaction with PARP was observed. These results represent an important progress towards the understanding of NAD(P)+-synthe-sis and the related energy and signaling processes. For the first time the key enzymes of NAD(P)+-synthesis in eukaryotic cells have become accessible to investigations in vivo and in vitro.