Charakterisierung der kardialen Inflammation und des Umbaus der extrazellulären Matrix in einem Coxsackievirus-B3-infizierten, murinen Myokarditismodell mit Urokinase-Typ Plasminogenaktivator-Gendeletion

Abstract

Die virale Myokarditis ist eine Erkrankung mit hoch variablem klinischem Verlauf. Nach einer initialen Entzündungsphase kommt es bei einem großen Teil der Patienten zu einer milden Verlaufsform mit geringer Symptomatik. Bei einem Teil der Patienten mit zunächst fulminantem Verlauf und kardialer Dilatation kommt es im Anschluss zu einer kompletten Genesung mit Normalisierung der Herzfunktion. Andererseits führt die Entzündungsreaktion bei einem kleineren Teil der Patienten zu einer gravierenden Herzschädigung mit konsekutiver Herzinsuffizienz. So kann eine akute Coxsackievirus-B3-induzierte Myokarditis zu einer ausgeprägten kardialen Infiltration durch Entzündungszellen, vermehrter Expression proinflammatorischer Zytokine und einer gesteigerten Aktivität matrixdegradierender Enzyme im Myokard führen. Sowohl viruszytopathische Effekte als auch die infektionsbedingte Immunreaktion werden als kausale Faktoren für das im Anschluss beobachtbare kardiale remodeling und die kardiomyozytäre Nekrose angesehen. Die Protease Urokinase- Typ Plasminogenaktivator (uPA) ist bei einer Reihe äthiologisch unterschiedlicher Herzerkrankungen am kardialen remodeling und der kardialen Inflammation beteiligt. uPA kann verschiedene Matrixmetalloproteinasen aktivieren und begünstigt durch perizelluläre Proteolyse die mykardiale Infiltration durch Immunzellen. Eine erhöhte MMP-Aktivität und ein entzündliches Infiltrat aus Immunzellen sind entscheidend in die Pathogenese der viralen Myokarditis involviert. In der vorliegenden Studie wurde bei Wildtypmäusen und uPA-deletierten Mäusen (uPA-/-) des Stammes C57BL/6 durch CVB3-Infektion eine akute virale Myokarditis induziert. Daneben dienten scheininfizierte Wildtyp-Mäuse und uPA-/--Mäuse als Kontrollgruppen. Die Gruppengröße betrug jeweils n = 6. Das Myokard der Tiere wurde am 7. Tag p.i. entnommen und mittels molekularbiologischer Techniken, histochemischer und immunhistochemischer Färbemethoden untersucht. Mittels semiquantitativer RT- PCR erfolgte die Untersuchung der Genexpression wichtiger Proteasen, Zytokine und Matrixbestandteile. Die Expressions-level wurden am housekeeping gene 18S- RNA relativiert und die Gruppen untereinander verglichen. Erfasst wurden die Transkripte der Proteasen uPA, tPA, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MT-1-MMP, EMMPRIN sowie deren Inhibitoren TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4 und PAI-1. Weiterhin wurden die Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10, IL-15, TNF-α, TGF-β, INF-γ sowie die Matrixbestandteile Kollagen I, Kollagen III, Laminin und Fibronectin untersucht. Mittels Gelatinezymographie wurde die Aktivität der Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 bestimmt. Die Charakterisierung der kardialen Infiltration durch Immunzellen erfolgte anhand immun-histochemischer Färbungen von CD-4+-, CD-8+-, CD-11b+-Zellen und neutrophilen Granulozyten. Kardiales Kollagen wurde histochemisch mit Sirius red gefärbt. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Expressionssteigerung von uPA und allen erfassten MMPs bei CVB3-Infektion. Daneben zeigte sich bei Infektion eine signifikante Aktivitätszunahme für MMP-2 und MMP-9. Durch uPA-Deletion wurden bei CVB3-Infektion die Expressions-level von MMP-8 und MMP-9 signifikant gesenkt und die MMP-9-Aktivität signifikant gemindert. Alle erfassten proinflammatorischen Zytokine waren bei Infektion signifikant induziert. Die uPA-Deletion bewirkte bei Infektion eine signifikante downregulation der Expression von IL-1β und IL-6. Die Untersuchung verschiedener ECM-Bestandteile zeigte bei Infektion eine signifikante Expressionssteigerung für Kollagen I, Kollagen III und Fibronectin. Die Auswertung der immunhistochemischen Färbung zeigte bei Infektion eine erhebliche Infiltration durch CD-4+-, CD-8+-, CD- 11b+-Zellen und neutrophile Granulozyten. Eine uPA-Deletion verringerte bei Infektion die Infiltration des Myokards durch alle erfassten Entzündungszelltypen signifikant. Insgesamt führte die uPA-Deletion zu einer effektiven Verringerung der destruktiven kardialen Entzündungsreaktion während einer akuten viralen CVB3-Myokarditis. In der Spätphase der Infektion konnte in der Arbeit von Heymans et al. gezeigt werden, dass eine uPA-Deletion vor kardialer Schädigung, Dilatation und Herzinsuffizienz schützt (Heymans et al., 2006). Die Ergebnisse der Studie lassen eine experimentelle, selektive Proteaseinhibition zur Reduktion des kardialen remodeling und der kardialen Inflammation sowie konsekutivem Schutz vor kardialer Fehlfunktion als Gegenstand weiterer Forschungsbemühungen für sinnvoll erscheinen.

Acute viral myocarditis is an important cause of cardiac failure in young, otherwise healthy adults and may result in idiopathic dilated cardial myopathy. Viral myocarditis caused by Coxsackievirus-B3 (CVB3) is characterized by viral infection of cardiomyocytes followed by a pronounced infiltration of inflammatory cells. Both direct infection of myocytes by the virus and the immune reaction after viral infection may cause myocyte necrosis and cardiac dysfunction. The proteinase urokinase-type plasminogen activator (uPA) has been implicated in cardiac repair and remodeling after cardiac injury or stress. UPA activates different matrix metalloproteinasis (MMPs) and helps pericellular proteolysis; through this uPA enables myocardial immunecell infiltration. The present study aimed to investigate whether increased expression of uPA may mediate acute inflammation and remodeling of the extracellular matrix. Therefore, uPA gene inactivation was evaluated for its ability to held the cardiac consequences of viral myocarditis in a mouse model of human CVB3-induced myocarditis. Six- to eight-week-old inbred C57BL/6 uPA knockout mice and wild-type littermates of either sex were used. The mice were sacrificed on day seven post infection. The myocard has been examinated by molecularbiologic, histochemical and immunehistochemical methods. By semiquantitative RT-PCR gene expression of proteinasis, cytokines and matrixproteins have been examinated. Expression levels have been relativated on the housekeeping gene 18S-RNA, and groups were compared by statistical methods. The transcript levels of the proteinasis uPA, tPA, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MT-1-MMP, EMMPRIN and their inhibitors TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4 and PAI-1 were recorded. Furtheron the transcript levels of the cytokines IL-1b, IL-6, IL-10, IL-15, TNF-a, TGF-b, INF-g and the structure proteins collagen I, collagen III, laminin and fibronectin were measured. The activity of MMP-2 and MMP-9 has been recorded using gelatinezymography. The cardial infiltration was characterized by immunostaining of CD-4, CD-8, CD-11b-cells and neutrophil granulocytes. Cardial collagen was stained by sirius red. The results show a significant upregulation of uPA and MMPs transcript levels during CVB3 infection. Furthermore CVB3 infection caused increased activity of MMP-2 and MMP-9. UPA deletion during CVB3 infection caused significant MMP-8 and MMP-9-transcript level downregulation and significant decreased MMP-9 activity. The transcript levels of all measured cytokines were significantly induced during CVB3 infection. UPA deletion caused significant downregulation of IL-1b and IL-6. Expression levels of the structural proteins collagen I, collagen III and fibronectin were significantly increased during infection. The immunohistochemical staining showed considerable infiltration with CD-4-, CD-8-, CD-11b-cells and neutrophil granulocytes. UPA deletion decreased the myocardial infiltration of all stained celltypes significantly. Alltogether loss of uPA activity reduced the cardiac inflammatory response after CVB3 infection, thereby protecting against cardiac injury and failure during CVB3 infection. These results implicate a promissing novel approach of experimental, selective proteinase inhibition to reduce the cardiac remodeling and the cardiac inflammation, thereby protecting against cardiac dysfunction.