Characterization of THRα Isoforms in the Developing Human Brain: Insights from RNA-Sequencing and a Novel Splicing Detector for in vitro Imaging

Abstract

Thyroid hormone receptor alpha (THRα) is a nuclear receptor for thyroid hormone triiodothyronine (T3). It is encoded by the THRA-gene and functions as a transcription factor for genes involved in development, metabolism and reproduction. In mammals, THRα has two major isoforms that differ at their 3’-end, THRα1 and THRα2. THRα1 is the better characterized isoform, has 9 exons that include a Ligand Binding Domain (LBD) for T3 and acts in complex with other proteins as a transcription factor. THRα2 on the other hand, is a less well characterized isoform, encoded by 10 exons. It lacks the LBD and is thought to function as a weak inhibitor of THRα1. Therefore, the local tissue- specific ratio of THRα1:THRα2 may determine the responsiveness of a specific cell population to thyroid hormone in different tissues and might have a key role during development. To date, the isoform-specific levels of THRα isoforms have not been characterized in healthy human tissues nor in the healthy human developing brain. Among the reasons for this, is the lack of isoform-specific antibodies or a tool to visualize and quantify THRA splicing events. To fill these gaps, (i) we used bulk and single cell RNA-sequencing to characterize the expression pattern of THRα isoforms in healthy adult human tissues and in the developing brain, and (ii) we developed and tested a THRA splicing detector that allows in vitro visualization and quantification at single cell resolution of THRA1 and THRA2 splicing events. We discovered a predominance of THRA2 transcripts in the central nervous system in healthy human adult tissues in general, and a specifically strong predominance of THRA2 transcripts during early stages of human cortical brain development. Additionally, we generated the first Splicing Detector that allows the readout of THRA splicing isoforms and their quantification in living cells by life- cell microscopy.

Der Schilddrüsenhormonrezeptor alpha (THRα) ist ein nukleärer Rezeptor für das Schilddrüsenhormon Trijodthyronin (T3). Er wird durch das THRA-Gen kodiert und fungiert als Transkriptionsfaktor für Gene, die an Entwicklung, Stoffwechsel und Fortpflanzung beteiligt sind. Bei Säugetieren hat THRα zwei Hauptisoformen, die sich an ihrem 3'-Ende unterscheiden, THRα1 und THRα2. THRα1 ist die besser charakterisierte Isoform, hat 9 Exons, die eine Ligandenbindungsdomäne (LBD) für T3 enthalten, und wirkt im Komplex mit anderen Proteinen als Transkriptionsfaktor. THRα2 hingegen ist eine weniger gut charakterisierte Isoform, die von 10 Exons kodiert wird. Ihr fehlt die LBD und man nimmt an, dass sie als schwacher Inhibitor von THRα1 fungiert. Daher könnte das lokale gewebespezifische Verhältnis von THRα1:THRα2 das Ansprechen bestimmter Zellpopulationen auf Schilddrüsenhormon in verschiedenen Geweben bestimmen und während der Entwicklung eine Schlüsselrolle spielen. Bislang wurden die Isoform spezifischen Spiegel der THRα-Isoformen weder in gesundem menschlichem Gewebe noch im sich entwickelnden gesunden menschlichen Gehirn charakterisiert. Einer der Gründe dafür ist das Fehlen von Isoform-spezifischen Antikörpern oder eines Instruments zur Visualisierung und Quantifizierung von THRA-Spleißvorgängen. Um diese Lücken zu schließen, (i) haben wir Massen- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet, um das Expressionsmuster von THRα-Isoformen in gesundem, erwachsenem menschlichem Gewebe und im sich entwickelnden Gehirn zu charakterisieren. Darüber hinaus (ii) haben wir einen THRA-Spleißdetektor entwickelt und getestet, der die in-vitro Visualisierung und Quantifizierung von THRA1- und THRA2-Spleißereignissen mit Auflösung auf Einzelzellebene ermöglicht. Wir entdeckten ein Überwiegen von THRA2-Transkripten in verschiedenen Teilen des Zentralnervensystems bei gesunden erwachsenen Menschen. Ein besonders starkes Überwiegen von THRA2-Transkripten fanden wir in den frühen Stadien der Hirnkortex-Entwicklung des Menschen. Darüber hinaus haben wir den ersten Spleißdetektor entwickelt, der es ermöglicht, THRA-Spleißisoformen in lebenden Zellen mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie auszulesen und zu quantifizieren.