Zweiphotonenmikroskopie mit zeitlicher und räumlicher Femtosekundenlaser-Pulsformung

Abstract

Im Mittelpunkt der vorliegenden Dissertation steht die Erweiterung eines Zweiphotonenmikroskops mit adaptiven Optiken zur qualitativen Untersuchung des Potenzials der spektralen und räumlichen Phasenanpassung. Zunächst wurde das Zweiphotonenmikroskop, das ich während meiner Diplomarbeit in Form eines Proben-Scanning-Aufbaus realisierte, eingehend hinsichtlich der mechanischen Bauteile und des optischen Aufbaus charakterisiert. Hierzu wurden die Schrittmotoren der Probenbewegung in allen drei Raumrichtungen (x, y und z) bezüglich der Präzision und Stabilität untersucht und die Auflösung des Zweiphotonenmikroskops mit Hilfe von fluoreszierenden Mikrosphären gemessen. Es zeigte sich, dass die Probenbewegung eine hohe Stabilität, Genauigkeit und Wiederholbarkeit aufweist, die die Anforderungen an die Positionierung für Messungen im Beugungslimit der Zweiphotonenmikroskopie erfüllen. Darüber hinaus ergab die Messung der Auflösung, dass der Fokus des optischen Aufbaus beugungsbegrenzt ist. Im Weiteren habe ich die grundsätzliche Funktionsweise des Zweiphotonenmikroskops in konkreten Anwendungen nachgewiesen. In ersten 4D-Messungen an biologischen Proben konnte ich die Struktur der Epidermis visualisieren sowie die Zellkörper von gefärbten Keratinozyten aus einer Zellkolonie identifizieren und vermessen. Mit der Integration sowohl des zeitlichen Laserpuls-, als auch des Wellenfront- Formers wurde das Zweiphotonenmikroskop zu einem einzigartigen System weiterentwickelt, das die simultane Manipulation der spektralen Phasen und der Wellenfront der Femtosekunden-Laserpulse erlaubt. Ultrakurze Laserpulse unterliegen in optischen Aufbauten spektralen sowie räumlichen Aberrationen, die sich negativ beispielsweise auf die Intensität im Fokus auswirken. Dabei handelt es sich grundlegend um Phasenänderungen, die das Interferenz- Verhalten des Spektrums bzw. derWellenfront im Fokus beeinflussen. Ich konnte zeigen, dass die Messung und Pre-Kompensation der spektralen und räumlichen Phasen am Ort der Probe in Anwesenheit einer künstlich eingeführten optischen Störung die Rückgewinnung eines zwei-photonischen Signals bei unverändertem Fokusvolumen erlaubt. Meine Studien-Ergebnisse zur räumlichen und zeitlichen Laserpuls-Formung in der Zweiphotonenmikroskopie konnte ich im Journal „Review of Scientific Intruments“ unter dem Titel „A stage-scanning two-photon microscope equipped with a temporal and a spatial pulse shaper: Enhance fluorescence signal by phase shaping“ [1] veröffentlichen.

This doctoral thesis focuses on the extension of a two-photon-microscope using adaptive optics. It is dedicated to qualitatively investigate the potential to compensate for spectral and spatial phase distortions which are occurring on ultrashort laser pulses during propagation. At first, the two-photon-microscope, which I previously set up throughout my diploma thesis as sample-scanner, was characterised regarding its mechanical and optical components. The precision and stability of the stepper motors for all three directions in space (x, y and z) were validated, and the resolution of the two-photon-microscope was determined by means of fluorescent microspheres. I showed that the scanners perform a highly stable, precise and repeatable movement, allowing positioning at the diffraction limit of the given setup. In addition, the measurement of the resolution revealed a diffraction limited focal spot for the optical assembly. Furthermore, I performed measurements on biological samples, thus demonstrating the general function of the presented two-photon-microscope. In the first 4D-measurements on biological samples, I visualised the structure of the epidermis and was able to identify and estimate the size of fluorophore-labelled keratinocytes in a cell colony. By adding the temporal pulse shaper and the spatial wavefront shaper to the setup, I turned the two-photon-microscope into a unique system, allowing full simultaneous control over the temporal and spatial shape of the femtosecond laser pulses. Ultrashort laser pulses are subject to spectral and spatial aberrations while propagating through optical elements, which might lead to reduced intensities at the focal spot, for example. Basically, these aberrations are phase changes, which affect the interference of the spectral components and/or of the wavefront at the focus. I was able to show that we can measure the spectral and spatial phase aberrations, induced by an optically distortive element in the beam path, at the position of the sample, and, after pre-compensating these phases, we recovered the two-photon signal at a fixed focal volume. We published the results of these studies on spectral and spatial laser pulse and wavefront shaping in an article with the title ”A stage-scanning two-photon microscope equipped with a temporal and a spatial pulse shaper: Enhance fluorescence signal by phase shaping” [1] in the peer-reviewed journal ”Review of Scientific Instruments”.