Prüfung der Essentialität lebender Keime für die Förderung der intestinalen Laktosehydrolyse durch die mikrobielle ß-Galactosidase fermentierter Milchprodukte am Model des gnotobiotischen Göttinger Minischweins

Abstract

Die weltweit häufigste Ursache für Milchunverträglichkeit ist der Mangel an intestinaler ß-Galactosidase, wodurch es zur Laktosemalabsorption kommt. Fermentierte Milchprodukte werden aufgrund ihres Gehalts an mikrobiellen ß-Galactosidasen von Laktosemalabsorbern sehr viel besser vertragen als unfermentierte Milch.

Ziel der Arbeit war es zur Klärung der Frage beizutragen, ob die intestinale Laktosehydrolyse durch die mikrobiellen ß-Galactosidasen aus fermentierten Milchprodukten an die Präsenz lebender Keime im Produkt gebunden ist und ob diese mit dem Milchprodukt zugeführten Keime in der Lage sind sich im Magen- Darm-Trakt anzusiedeln. Dazu wurden Fütterungsversuche mit fermentierten Milchprodukten, die keine, abgetötete oder lebende Laktobazillen enthielten an gnotobiotischen Göttinger Minischweinen und gnotobiotischen Ratten durchgeführt.

In Vorversuchen wurde der Einfluß der Lagerungsdauer und der Magenpassage in vitro auf die Laktobazillen und deren ß-Galactosidase-Aktivität untersucht, sowie die Höhe der intestinalen ß-Galactosidase-Aktivität in unterschiedlichen Dünndarmabschnitten der Versuchtiere festgestellt.

Im Fütterungsversuch erhielten jeweils 6 Tiere beider Tierarten über je 2 Wochen nacheinander 3 unterschiedliche Diäten fermentierten Milchprodukts identischen Laktosegehalts (40 g/l). Die erste Diät enthielt keine Laktobazillen, die zweite mit g-Strahlen abgetötete und die dritte lebende Laktobazillen. Die beiden letzteren Diäten enthielten jeweils gleiche ß -Galactosidase-Aktivitäten (ca. 400 IU/l), in der ersten Diät war keine Aktivität zu vorhanden. Zur Deckung des täglichen Energie-und Nährstoffbedarf bekamen die Tiere Laktose- und ß-Galactosidase-freies Zusatzfutter.

Der Einfluß der drei Versuchsdiäten auf die intestinale Laktosehydrolyse wurde bei beiden Tierarten durch die orofäkale Laktosebilanzierung ermittelt, im Fall des Schweineversuchs, zusätzlich korregiert mit Werten eines nicht resorbierbaren Markers. Neben der Laktosebilanz wurde eine orofäkale ß-Galactosidasebilanz erhoben. Um das Adhäsionsverhalten der Laktobazillen zu untersuchen wurde während der Versuchsdiät mit den lebenden Keimen kurze Zeit mit der Keimgabe ausgesetzt und während der gesamten Periode wurden die Keimzahlen im Kot der Tiere ermittelt.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Die mit dem Kot ausgeschiedene Laktosemenge war bei Schweinen und Ratten während der ersten Versuchsdiät hoch und sank unter den beiden folgenden Versuchsdiäten stark ab. Zwischen den Laktosemengen im Kot unter Diät 2 verglichen mit Diät 3 waren, ebenso wie jeweils zu Diät 1, statistisch signifikante Unterschiede zu finden, die aber etwas geringer waren als die beider Diäten (3 und 2) zu Diät 1. Dieses Ergebnis bei den Schweinen wurde auch nach Bezug auf die Markerwerte nicht verändert. Es zeigte sich, daß die Verdaulichkeit der Laktose in Diät 1 wesentlich geringer war als in Diät 2 und 3. Die Laktoseverdaulichkeit von Diät 2 und 3 war nicht signifikant unterschiedlich.

Gegensätzlich zur Laktose verhielt sich die im Kot nachweisbare ß -Galactosidase-Aktivität. Während Diät 1 wurden geringste Mengen bis gar keine ß-Galactosidase-Aktivität gemessen, unter Diät 2 stieg sie an, um während Diät 3 den höchsten Wert zu erreichen. Die Unterschiede aller drei Diäten zueinander waren statistisch signifikant.

Der verabreichte Laktobazillenstamm war nicht in der Lage sich im Dünndarm der gnotobiotischen Minischweine und Ratten dauerhaft zu etablieren, er verschwand nach Aussetzten der oralen Zufuhr innerhalb von Tagen.

Aus diesen Ergebnissen konnte folgender Schluß gezogen werden: Die intestinale Laktosehydrolyse nach Aufnahme von fermentierten Milchprodukten war dann am höchsten, wenn mit der Diät mikrobielle ß-Galactosidase aufgenommen wurde, dabei machte es nur einen geringen Unterschied, ob die Laktobazillen lebten oder abgetötet waren; die intestinale Laktosehydrolyse war unter der Diät mit lebenden Laktobazillen etwas höher als unter der Diät mit den abgetöteten. Wesentlich war, daß das Enzym, geschützt durch die Hülle der Laktobazillen, die Magenpassage überstehen konnte, ohne durch Magensäure und Proteasen zerstört zu werden. Dies wurde deutlich in in vitro Versuchen zur Prüfung des Überstehens der Magenpassage gezeigt. Diesen Schutz bieten mit g-Strahlen behandelte (abgetötete) Laktobazillen fast genauso gut wie lebende Laktobazillen. Solange die Zellmembran der Keime intakt ist, ist es für die Förderung der intestinalen Laktosehydrolyse nicht essentiell, daß die Keime viabel sind.

The most common reason worldwide for the indigestibility of milk is the lack of ß-galactosidases in the small intestine, leading to the malabsorbtion of lactose. Fermented dairy products are very often much better tolerated than raw (not fermented) milk, because of the microbial ß-galactosidases they contain.

The aim of this thesis was to elucidate the question as to weather lactose hydrolysis in the small intestine requires the presence of living bacteria (with their microbial ß-galactosidases) in fermented dairy products and weather the bacteria of these dairy products are able to colonize the gut. To this end several feeding experiments with gnotobiotic Göttingen Minipigs and gnotobiotic rats were carried out to investigate the influence of killed versus living bacteria in fermented dairy products. A bacteria-free diet without ß-galactosidase activity was fed as a control.

In preliminary experiments the influence of the passage through the stomach on ß-galactosidase activity was tested as well as effects of the storage of lactobacilli on the ß-galactosidase activity. Also the intestinal ß-galactosidase activity of the pigs and rats was investigated in different parts of the small intestine.

In the main experiment six animals of both species were fed sequentially (over a period of two weeks) with three different fermented dairy product-diets each having an identi-cal lactose content (40g/l). The first diet contained no, the second by g-rays killed and the third living lactobacilli. In the first diet there was no ß-galactosidase activity, whereas both the second and the third diet possessed the same ß-galactosidase activity (400 IU/l). The experimental diets were supplemented with an lactose-and ß-galactosidase-free feed to cover the energy and nutrient requirements.

The influence of these three diets on the lactose hydrolysis in the intestine was investigated by comparing the relationship between the lactose which was eaten and that which was defecated. In the porcine model system the data were corrected with a marker which could not be absorbed in the intestine. In addition to the lactoserelation-ship that of the ß-galactosidase was also determined. During the diet, which contained viable bacterial cultures, the dose of the bacteria was stopped for several days in order to find out if the bacteria could adhere to the intestine. Throughout the entire period, the number of bacteria was determined in the feces of the animals to document possible differences.

The results were as follows: The quantity of lactose which was eliminated in the feces was high during the first diet, in both the rodent and the porcine systems, and dropped significantly in both of the subsequent diets. The differences between the fecal lactose content of diet two and three and diet two and one were statistically significant. However the former was more pronounced than the latter. The same results were found after comparison of the data after marker correction. It was shown that the digestibility of the lactose under the first diet was much lower than under the second and third diet. The lactose digestibility between diet two and three was not found to be statistically significantly different.

In contrast to the data for lactose, the ß-galactosidase activity data showed differences. Under diet one very low amounts of the ß-galactosidase activity could be measured. Under diet two the activity rose and reached the maximum level under diet three. The differences between all three diets were statistically significant.

The lactobacillus strain used was unable to colonize the small intestine of the Göttingen Minipigs and the rats for any length of time. After stopping the dose per os, the bacte-ria disappeared from the gut.

The following conclusions could be drawn from the experiments presented in this the-sis: The intestinal lactose hydrolysis after eating fermented dairy products was highest where microbial ß-galactosidase was presented in the diet. There was not a great dif-ference if the bacteria were viable or non-viable; the intestinal lactose hydrolysis was a little bit higher under the diet with the viable lactobacilli compared to those under the diet with the non-viable bacteria. However it was important for the survival of the en-zyme during the passage through the stomach that it be protected by the cell wall of the lactobacilli. As it would otherwise be destroyed by the acid and proteases in the stom-ach. This was shown by in vitro experiments. Nearly the same level of protection was given by the g-ray-inactivated bacteria as by the living lactobacilli. As long as the mem-brane of the cells were intact it was not essentiel for lactose hydrolysis that the bacteria were viable.