Identification and functional validation of new genetic mutations in primary mediastinal B-cell lymphoma

Abstract

Primary mediastinal B-cell lymphoma (PMBCL), a rare but aggressive lymphoma prevalent in young women, shares genetic and phenotypic features with classical Hodgkin's lymphoma (cHL) and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). The limited knowledge of PMBCL's molecular pathogenesis and its impact on disease progres- sion and therapy response necessitates a comprehensive investigation. This thesis aims to bridge this knowledge gap by identifying and characterizing new genetic lesions in PMBCL using a combination of two investigative approaches. Whole exome sequencing (n = 78) and a customized targeted sequencing panel (n = 486) of primary PMBCL samples uncovered recurrent somatic mutations in the chromatin regulator and transcription factor ZNF217 with a frequency of 27% in newly diagnosed patients. While various studies on aggressive B-cell lymphomas have delineated epigenetic regulation as an emerging pathogenic hallmark of lym- phomagenesis, the specific role of epigenetic programming in PMBCLs and the functional consequences of aberrations in ZNF217 remain inadequately under- stood. To investigate functional consequences of this recurrently mutated gene, I established and optimized a highly efficient CRSPR/Cas9-mediated genome editing method using the direct transfection of Cas9-RNPs for gene knock-out (80% effi- ciency) or to introduce specific ZNF217 mutations in PMBCL, DLBCL and cHL cell lines (18% efficiency). Stable and homogenous single cell-derived knock-out clones harboring the desired mutations in ZNF217 were created successively and studied regarding their functional impact. ZNF217KO cells showed remarkable differences regarding proliferation, migration, and apoptosis if compared with their respective wild-type counterparts suggesting an influence on critical hallmarks. In addition, I examined somatic mutations and somatic copy number aberrations along with clinical data to formulate multivariable prognostic models that extend cur- rent strategies for risk assessment (n = 304). These multivariable Cox regression models reliably identified mutations in CD58 and DUSP2 as important predictors of progression-free survival and overall survival. Subsequently created cross-validated Lasso models internally validated the novel molecular markers and successfully identified patients at a heightened risk of disease progression and mortality with a precision surpassing that of existing clinical prognostic approaches. In summary, this thesis tackled a crucial gap in the current understanding of the molecular intricacies of PMBCL by identifying ZNF217 as an important epigenetic regulator. The in-depth analysis of the largest PMBCL clinico-molecular dataset to date revealed the potential benefit of incorporating molecular risk markers enabling a more precise risk stratification, and thus offering the promise of optimized and personalized treatment decisions.

Das primäre mediastinale B-Zell-Lymphom (PMBCL), ein seltenes, aber aggressiv- verlaufendes Lymphom, das vor allem bei jungen Frauen auftritt, zeigt ähnliche ge- netische Merkmale wie das klassische Hodgkin-Lymphom (cHL) und das diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL). Die molekulare Pathogenese des PMBCL und ihre Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf sowie das Ansprechen auf The- rapien ist bisher unzureichend untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, diese Wissens- lücke durch die Identifizierung und Charakterisierung neuer genetischer Läsionen beim PMBCL zu schließen. Die Exom-Sequenzierung (n = 78) und ein zielgerichtetes Sequenzierungspanel (n = 486) von primären PMBCL-Proben identifizierten wiederkehrende Mutationen im Chromatin-Regulator und Transkriptionsfaktor ZNF217 mit einer Häufigkeit von 27 % bei neu diagnostizierten Patient*innen. Obwohl verschiedene Studien zu aggres- siven B-Zell-Lymphomen die epigenetische Regulation als neues pathogenetisches Merkmal betonen, ist die spezifische Rolle der epigenetischen Programmierung bei PMBCLs und die funktionellen Folgen von ZNF217-Aberrationen noch weitestge- hend unerforscht. Um die funktionellen Konsequenzen zu ergründen, entwickelte und optimierte ich eine hocheffiziente CRISPR/Cas9-vermittelte Genome-Editing- Methode. Cas9-RNPs wurden direkt transfiziert, um Gene zu deaktivieren (80 % Effizienz) oder spezifische ZNF217-Mutationen in PMBCL-, DLBCL- und cHL-Zellli- nien einzuführen (18 % Effizienz). Anschließend generierte ich stabile, homogene Knock-out-Klone aus Einzelzellen mit den gewünschten ZNF217-Mutationen und untersuchte ihre funktionellen Auswirkungen mit verschiedenen molekularbiologi- schen Assays. Die ZNF217KO-Zellen zeigten signifikante Unterschiede in Proliferation, Migration und Apoptose im Vergleich zu ihren Wildtyp-Pendants, was auf einen Einfluss auf pathogenetische Prozesse hindeutet. In der Analyse eines umfangreichen klinisch-molekularen Datensatzes (n = 304) mit somatischen Mutationen, Kopienzahlaberrationen und klinischen Daten habe ich multivariable Prognosemodelle entwickelt, um die derzeitig limitierten prognosti- schen Strategien zu erweitern. Diese multivariablen Cox-Regressionsmodelle iden- tifizierten Mutationen in CD58 und DUSP2 als wesentliche Prädiktoren für progres- sionsfreies Überleben und Gesamtüberleben. Kreuzvalidierte Lasso-Modellen zur internen Validierung der neuen molekularen Marker konnten Patient*innen mit ei- nem erhöhten Risiko für Progress und Sterblichkeit mit einer höheren Präzision er- kennen als bestehende klinische Prognoseansätze. Zusammenfassend schließt diese Arbeit eine wichtige Lücke im Verständnis der molekularen Mechanismen des PMBCL, indem sie ZNF217 als einen zentralen epi- genetischen Regulator identifiziert und charakterisiert. Die umfassende Analyse des bisher größten klinisch-molekularen PMBCL-Datensatzes zeigt den potenziellen Nutzen der Einbeziehung molekularer Risikomarker für ein präzisere Risikostratifizierung, welche personalisierte und bessere Behandlungsentscheidungen ermöglichen können.