Coulomb controlled Iontophoresis of Carboplatin in the treatment of the transgenic murine retinoblastoma

Abstract

Objective: Retinoblastoma is the most common intraocular malignancy in children. Recently, the management of retinoblastoma has evolved away from radical aggressive treatments such as enucleation and external beam radiation, towards more focal, conservative treatments or moderate, combined treatment modalities. The aim of this study was to characterize the pharmacokinetics and toxicity of systemic versus focal subconjunctival and transscleral Coulomb controlled iontophoresis (CCI) of carboplatin administration in the rabbit eye. The next step was to evaluate the efficacy and the dose response of transcorneoscleral Coulomb controlled iontophoresis (CCI) of carboplatin in the treatment of murine transgenic hereditary retinoblastoma. Methods: Pharmacological distribution of carboplatin was examined in New Zealand White (NZW) rabbits following a single intravenous infusion of carboplatin (18.7mg/kg body weight), a single subconjunctival carboplatin injection (5.0mg/400µl), or a single application of carboplatin delivered with CCI at 5mA/cm2 for 20min treatment duration (14mg/ml carboplatin solution). Following each treatment, animals were euthanized and eyes were obtained at either 1, 2, 6 or 24hrs post treatment. Six animals per time point were treated to ensure statistical significance. Right eyes were treated, left eyes served as controls. Atomic absorption spectroscopy analysis was used to determine the carboplatin levels in the blood plasma and ocular tissues. Twelve adult NZW were used for histopathological and functional toxicity evaluation. The rabbits underwent 6 serial iontophoretic treatments (20min at 2.5mA) of either balanced salt solution (BSS) or carboplatin (14mg/ml) administered to the right eye at 72-hour intervals. The left eyes served as untreated controls. ERGs were recorded prior to the initial treatment, than at 48hrs after the 2nd treatment, and 4 weeks post final treatment. All eyes were examined clinically following each CCI application. Fifty-four 6 weeks old SV-40 transgenic mice underwent six, serial transcorneoscleral iontophoretic treatments (2.57mA/cm2, 5min) with carboplatin. Forty-four animals received carboplatin treatments at concentrations of 1.4, 7.0, 10.0, or 14mg/ml with or without current. Ten control mice underwent a treatment with balanced salt solution. Coulomb controlled iontophoresis treatment parameters include current density and charge application times were evaluated in 8 animals. Experimental and control eyes were examined for toxicity preceding each application. All eyes were obtained at 16 weeks of age for histopathological evaluation. Results: Determination of carboplatin concentrations via atomic absorption spectroscopy in the retina, choroid, vitreous humor, and optic nerve following subconjunctival injection and iontophoretic carboplatin delivery revealed significantly higher levels than those achieved with systemic administration. Peak levels of carboplatin in the retina were determined to be 53.68ng/mg following subconjunctival, 38.0ng/mg post CCI-delivery and 14ng/mg after intravenous administration at 1hour post treatment. Concentrations in the vitreous humor following treatments peaked at differing times: 1hr post subconjunctival injection (4560ng/ml), 6hrs post CCI delivery (1955ng/ml) and 6hrs post intravenous delivery (1220ng/ml). Carboplatin concentrations in the blood plasma were found to be significantly higher following intravenous delivery with a concentration of 6222ng/ml at 1hour, compared to concentration of 182ng/ml and 261ng/ml at 1hour for subconjunctival and iontophoretic drug delivery. Light microscopy showed no histopathologic alterations in eyes treated with single or repetitive CCI carboplatin. ERGs revealed no depression in the a- or b-wave amplitude or alteration in the implicit times of the treated eyes. A dose dependent inhibition of intraocular tumor was observed following repetitive iontophoretic treatment. None of the experimental eyes treated at carboplatin concentrations of 1.4mg/ml demonstrated complete tumor control. At concentrations of 7mg/ml the treated eyes exhibited tumor control of 50 %. All eyes treated with 14mg/ml showed complete tumor control. No corneal toxicity was observed in eyes treated at carboplatin concentrations less than 10mg/ml. At 14mg/ml all of the treated eyes revealed corneal damage. Conclusions: Focal administration of carboplatin utilizing subconjunctival or CCI, effectively transmits this chemotherapeutic drug into the target tissues of retina, choroid, vitreous and optic nerve. This data suggests local carboplatin delivery may be effective and well tolerated in the treatment of human retinoblastoma by increasing the intra-orbital carboplatin concentration while decreasing systemic exposure to this cytotoxic drug. Furthermore repetitive CCI administration demonstrated no signs of ocular toxicity and may present an alternative method to repetitive intravenous carboplatin administration. Transcorneoscleral Coulomb controlled iontophoretic delivery of carboplatin safely and effectively controls intraocular retinoblastoma in a dose dependent manner in this murine model of retinoblastoma. Topical non- invasive ocular iontophoretic administration of carboplatin chemotherapy may be advantageous in the treatment of intraocular pediatric retinoblastoma in comparison to systemically applied chemotherapy.

Einleitung: Das Retinoblastom ist der häufigste primäre maligne Augentumor des Kindesalters. Im letzten Jahrzehnt hat sich die Behandlung des Retinoblastoms von radikalen, aggressiven Methoden, wie Enukleation und externer Bestrahlung, zur Anwendung von mehr fokalen, konservativen oder kombinierten Behandlungsstrategien entwickelt. Ziel der vorliegenden Forschungsstudie war erstens die Evaluierung der Pharmakokinetik der systemischen transskleralen Coulomb-kontrollierten Iontophorese von Carboplatin am Kaninchenauge und die Untersuchung möglicher Toxizitätseffekte im Vergleich zur fokalen subkonjunktivalen Injektion. In einem zweiten Schritt wurde die Effektivität der transkorneoskleralen Coulomb-kontrollierten Iontophorese (CCI) von Carboplatin zur Behandlung des Retinoblastoms am transgenetischen Mausmodell untersucht. Methoden: Die pharmakologische Verteilung von Carboplatin wurde an New Zealand White Kaninchen im Anschluss an eine einzelne intravenöse Infusion von Carboplatin (18.7mg/kg Körpergewicht), eine einzelne subkonjunktivale Carboplatininjektion (5.0mg/400µl), oder eine einzelne Applikation einer Coulomb-kontrollierten Iontophorese (5mA/cm2) für eine Behandlungsdauer von 20min (14mg/ml Carboplatinlösung) untersucht. Die behandelten Tiere wurden 1, 2, 6, oder 24 Stunden nach der jeweiligen Behandlung euthanasiert und die Augen enukleiert. Sechs Tiere pro Zeitpunkt wurden jeweils am rechten Auge behandelt, das linke unbehandelte diente zur Kontrolle. Carboplatinkonzentrationen in der Netzhaut, der Aderhaut, des Nervus opticus und des Glaskörpers, sowie des Blutplasmas die wurden mittels Atomarer Absorptionsspektrophotometrie (AAS) bestimmt. 12 erwachsene Kaninchen wurden zur Evaluierung der histopathologischen und funktionellen Toxizität der mehrfach applizierten Coulomb-kontrollierten Iontophorese benutzt. Die Kaninchen unterliefen sechs CCI Behandlungen (20min, 2.5mA) mit entweder physiologischer Kochsalzlösung oder Carboplatinlösung (14mg/ml) am rechten Auge mit jeweils 72-Stunden Intervallen. Die linken Augen dienten als unbehandelte Kontrollaugen. Elektroretinogramme (ERG) wurden vor der ersten Behandlung, nach der zweiten Behandlung und 4 Wochen nach der letzten sechsten Iontophoreseapplikation durchgeführt. Alle Augen wurden im Anschluss an die Behandlung ophthalmoskopisch untersucht. Vierundfünfzig 6 Wochen alte SV 40 Tag Mäuse unterliefen sechs transkorneosklerale Iontophoresesitzungen (2.57mA/cm2, 5min) mit Carboplatin. Vierundvierzig Tiere erhielten Carboplatinbehandlungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von 1.4, 7.0, 10.0 oder 14.0mg/ml mit oder ohne Strom. Zehn Tiere wurden durch CCI (2.57/cm2, 5min) mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt. Sicherheitsparameter wie Stromstärke und Behandlungsdauer der Coulomb- kontrollierten Iontophorese wurden an acht weiteren Mäusen untersucht. Behandelte und Kontrollaugen durchliefen vor und im Anschluss an jede Behandlung eine ophthalmologische Untersuchung. Von allen Tieren wurden jeweils beide Augen im Alter von 16 Wochen für die histopathologische Einschätzung und die Graduierung der Tumorkontrolle enukleiert. Ergebnisse: In der Netzhaut, der Aderhaut, im Nervus opticus sowie im Glaskörper der Kaninchen, die mittels subkonjunktivaler Injektion oder CCI behandelt wurden, konnten signifikant höhere Carboplatinkonzentrationen gemessen werden, als in den Tieren, welche eine systemische intravenöse Carboplatininfusion erhielten. Höchstwerte wurden in der Netzhaut 1 Stunde nach Behandlung mit 53.7 ng/mg nach subkonjunktivaler Injektion, 45.3 ng/mg nach CCI und 21.6 ng/mg nach intravenöser Infusion gemessen. Mit 4560ng/ml Carboplatin im Glaskörper wurde der absolute Höchstwert der untersuchten Techniken eine Stunde nach subkonjunktivaler Injektion erreicht. Interessanterweise zeigten die CCI mit einem Wert von 1955ng/ml und die intravenöse Infusion von 1220ng/ml erst nach einer Zeitspanne von 6 Stunden die höchsten Werte im Glaskörper. Die Blutplasmawerte von Carboplatin zeigten deutlich höhere Konzentrationen nach intravenöser Infusion (6222µg/ml) als bei subkonjunktivaler Injektion (182µg/ml) und nach Coulomb- kontrollierter Iontophorese (261µg/ml). Es konnten keine Beeinträchtigungen oder Schädigungen auf histopathologischer als auch auf funktioneller Ebene weder bei einer wiederholten Coulomb- kontrollierten Iontophorese mittels physiologischer Kochsalzlösung noch bei Carboplatin-CCI festgestellt werden. Eine Dosis korrelierte Tumorkontrollkurve von wiederholten Carboplatin-CCI Behandlungen am Mausmodell konnte erstellt werden. Bei einer Carboplatinkonzentration von 7ng/ml wurde eine 50% Tumorkontrolle erreicht. Vollständige Tumorkontrolle wurde bei einer Konzentration von 14ng/ml gemessen, allerdings mit beachtlichen Schädigungen des Auges. Schlussfolgerung: Höhere Carboplatinkonzentrationen in Netzhaut, Gefäßhaut, Nervus opticus und Glaskörper wurden bei lokaler Behandlung mittels Coulomb kontrollierte Iontophorese und subkonjunktivaler Injektion als bei einer systemischen intravenösen Infusion gemessen. Die Integration der Coulomb-kontrollierten Iontophorese von Carboplatin in das Arsenal der bisher etablierten verschiedenen Behandlungsmethoden des Retinoblastoms eröffnet die Möglichkeit einer selektiveren und ergänzenden Behandlung des häufigsten okularen Tumors des Kindesalters.