Gentransfer von Interleukin-10-Protein in die Kornea: Untersuchungen zur Prävention der Transplantatabstoßung nach perforierender Keratoplastik

Abstract

Die Hornhauttransplantation ist die häufigste Allotransplantation humanen Gewebes, wobei ihr wegen guter postoperativer Ergebnisse eine Sonderrolle unter den Allotransplantationen eingeräumt wird. Dennoch stellt die immunvermittelte Allograftreaktion, die bei ca. 30% der Patienten auftritt, die häufigste Komplikation nach Keratoplastik dar. Daher steht zunächst der Erhalt des Transplantats im Vordergrund. Bisherige Therapieansätze wiesen häufig systemische Nebenwirkungen auf. Ein innovativer Ansatz ist die Immunmodulation durch das transplantierte Gewebe. Hierbei kann durch Gentransfer eine lokale Überexpression immunmodulatorischer Zytokine erzielt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von viralem Interleukin-10 auf die Immunreaktionen nach Keratoplastik untersucht und folgende Fragestellung bearbeitet: Kann durch das im Transplantat lokal und temporär überexprimierte TH2-Zytokin vIL-10 eine Modulation der Immunreaktionen nach Keratoplastik erzielt werden, die ein längeres Transplantatüberleben ermöglicht? Welche Entzündungszellen überwiegen im Transplantat? Welche Entzündungszellen werden durch Interleukin-10 gehemmt? In welchem Teil des Transplantats finden sich Entzündungszellen? Das immunmodulatorische Zytokin vIL-10 wurde mit Hilfe von Adenoviren ex-vivo in korneale Transplantate eingebracht. Nach erfolgreichen in-vitro-Untersuchungen zur Genexpression wurden die transduzierten Hornhäute im Keratoplastikmodell der Ratte transplantiert. Als Kontrollen dienten unbehandelte allogene Transplantate sowie mit einem Adenoviruskonstrukt ohne therapeutisches Gen transduzierte Hornhäute. Die Tiere wurden nach der Transplantation über 4 Wochen biomikroskopisch nachbeobachtet und die Transplantatüberlebenszeiten verglichen. Die Untersuchung der Tiere zeigte, dass der Einsatz des therapeutischen Gens keine Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit bewirkte. Zur immunhistochemischen Darstellung der Immunpathologie wurden die Hornhäute der Ratten zu definierten Zeitpunkten entnommen und mittels ABC- (Avidin-Biotin-Komplex-Immunoperoxidase-) Technik getrennt nach Empfängerbett und Transplantat aufgearbeitet. Die spezifisch angefärbten Zellen wurden statistisch ausgewertet und in den drei Gruppen verglichen. Die Zellzahl stieg an und hatte zum Zeitpunkt der Abstoßung am etwa 17. Tag ihr Maximum. Die größte Gruppe bildeten die Monozyten. Auch CD8+Zellen und NK-Zellen traten gehäuft auf. Ein leichter suppressiver Effekt von vIL-10 war am Tag 10 bei den CD4+Zellen und in schwächerem Maße bei den CD8+ sowie bei den Natürlichen Killerzellen sichtbar. Auf die Zahl der Monozyten, Dendritischen T-Zellen und B-Lymphozyten wies vIL-10 keinen Einfluss auf. Weiterhin zeigte sich, dass sich am Tag 10 in allen Gruppen die meisten Zellen in der Empfängerkornea befanden, wohingegen sich am Tag 17 die meisten Zellen im Übergangsbereich nachweisen ließen. Am Tag 24 schließlich waren die Entzündungszellen in das Transplantat immigriert und das Transplantat wurde als abgestoßen betrachtet. Die Immunhistologie bestätigte, dass der lokale adenovirale Gentransfer in die Korneae nicht zur gewünschten Immunmodulation führte. Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass der lokale Gentransfer von vIL-10 möglich ist, in der Keratoplastik in dieser Form allerdings keine immunsuppressive Wirkung zeigt. Dennoch scheint der Gentransfer grundsätzlich eine Möglichkeit in der Abstoßungsprävention zu sein und muss in weiteren Arbeiten untersucht, variiert und optimiert werden.

Corneal transplantation is the most common allotransplantation of human tissue with very good postoperative results. The allograft reaction observed in 30% of patients is still the main complication after keratoplasty. The conservation of the graft is the main intention therefore. Former therapy approaches featured systemic adverse effects. One innovative approach is immunomodulation by the transplanted tissue. A local overexpression of immunomodulatory cytokines can be achieved by gene transfer. The influence of viral interleukin-10 on the immune reaction after keratoplasty was investigated in this study and the following questions were responded: Does the local and temporarily overexpressed viral interleukin-10 in the graft effect a modulation of the immune reaction after keratoplasty and provide a longer survive of the graft? Which immune cells dominate in the graft? Which immune cells are inhibited by interleukin-10? In which part of the graft are the immune cells at which time point? The immunomodulatory cytokine interleukin-10 was inserted in corneal grafts by ex-vivo adenoviral gene transfer. The transduced Wistar-Furth grafts were transplanted in Lewis rats after successful in-vitro investigations of gene expression. Non treated allogeneic grafts and grafts transduced by a viral vector without therapeutic gene acted as controls. The rats were investigated with a slit lamp over 4 weeks after transplantation and the surviving time of the grafts were compared. The therapeutic gene did not effect a longer graft survival. The grafts were explanted at one of three predetermined time points and immune cells were stained using avidine-biotin-compleximmunoperoxydase- technique differentiated in graft and host tissue in order to investigate the immune pathology. Stained cells were analysed statistically and compared in the three groups. Number of immune cells increased up to the 17th postoperative day in order to decrease again up to the 24th day. Monocytes were most numerously, CD8+cells and Natural Killer cells were common, too. A gentle immunsuppressive effect of viral interleukin-10 to CD4+cells was detected at day 10 and just a little to CD8+cells and Natural Killer cells. No effect of interleukin- 10 to the number of Monocytes, Dendritic cells and B-lymphocytes was observed. Furthermore a migration of the immune cells was worked out in all of the three groups: At 10th postoperative day most cells were found in the host cornea, whereas graft was nearly free of cells. Most immune cells had immigrated at 17th postoperative day in the scar area and arrived at 24th day in the graft, which was considered to be rejected. Immunhistological evaluation verified that a local adenoviral gene transfer in rat corneal grafts did not provide a sufficient immunomodulation. This data indicate that the local gene transfer of viral interleukin-10 is feasible, but has no sufficient immunosuppressive effect in keratoplasty model of the rat. Anyhow gene transfer seems to be a possible alternative in prevention of rejection and has to be varied and optimized in further investigations.