Phosphoinositide (PI) sind strukturelle Bestandteile der Zellmembranen und auch an verschiedenen Signalwegen im Zytoplasma und Zellkern beteiligt. Diese Arbeit befasst sich näher mit Phospholipasen der Klasse C, sowie einem Gen mit einer Ähnlichkeit zu Phospholipase A2 aktivierenden Proteinen im humanpathogenen Pilz Candida albicans. Im Genom von C. albicans wurden 3 Gene gefunden, die für intrazelluläre Phospholipasen C kodieren, CaPLC1, CaPLC2 und CaPLC3. Diese wurden im Hinblick auf ihre Rolle und Funktion in C. albicans genauer untersucht. Dazu wurden die Gene ausgeschaltet und die Mutanten analysiert. CaPLC1 scheint essentiell zu sein, da eine Disruption des zweiten Allels nicht erfolgreich war. Eine konditionelle Mutante zeigte ähnliche Phänotypen wie die PLC1-Mutante in Saccharomyces cerevisiae, wie Temperatursensitivität, gehemmtes Wachstum bei osmotischem Stress und auf Medien mit Arginin als alleinige Stickstoffquelle. Die heterozygote Mutante zeigte zusätzlich eine verzögerte Filamentbildung auf einigen hypheninduzierenden Medien und die Hemmung durch Nocodazol. Die gefundenen Phänotypen stimmen mit denen der ScPLC1-Mutante weitestgehend überein, was für CaPlc1 eine ähnliche Rolle vermuten lässt. Ein Microarray-Experiment zeigte ebenfalls die Vielfältigkeit und Verzweigung der betroffenen Signalwege und deutete auf mehrere Funktionen hin. Herauszuheben ist eine Verbindung der CaPlc1-Funktion mit dem Transkriptionsrepressor CaNrg1. Während CaPlc1 strukturell eine typische eukaryotische Phospholipase C ist, ähneln die fast identischen Proteine CaPlc2 und CaPlc3 strukturell den prokaryotischen Phospholipasen C. Sie können den Verlust von CaPlc1 nicht kompensieren. Trotz unterschiedlicher Promotorregionen sind die Transkriptionsprofile beider Gene sehr ähnlich. Beide Gene sind nicht essentiell, denn Doppelmutanten überleben bei kaum veränderten Phänotypen. Sie zeigen verzögerte Hyphenbildungen auf CAA-, YCB-BSA- und Spider-Medium. Dennoch zeigten sich im Vergleich zum Wildtypstamm keine Unterschiede im systemischen Mausinfektionsmodell. Der zweite Teil der Arbeit galt dem mit CaDOA1 bezeichneten Gen, das Homologien zum Säugerprotein PLAP (Phospholipase A2 aktivierendes Protein) und DOA1 in S. cerevisiae aufweist. CaDoa1 hat WD-repeats in der Sequenz und eine mellitinähnliche Sequenz, die für die vollständige Funktionalität des Proteins nötig ist. CaDOA1 wird sowohl in der Hefe-, als auch Hyphenform transkribiert. Die Mutante weist einen hyperfilamentösen Phänotyp auf. Sie wächst in einem Filamentgemisch aus Pseudohyphen und Hyphen unter Hefebedingungen. Neben weiteren Phänotypen tritt auch die erhöhte Sensitivität gegenüber Propranolol, Butanol, Coffein, Chelatoren, Azolen, Nocodazol und Cadmium auf. Ein Microarray-Experiment und ein Enzymassay zur Bestimmung der Phospholipaseaktivitäten bestätigten die Verbindung der CaDoa1 Funktion mit dem Ubiquitin-vermittelten Proteinabbau und der Aktivität von Phospholipasen.
Phosphoinositides (PI) are structural components of cell membranes and important second messengers too. The present work investigated class C phospholipases of the human-pathogenic fungus Candida albicans and a gene with similarity to a phospholipase A2 activating protein. At least three genes in the genome of Candida albicans encode intracellular phospholipases C (PLC1, CaPLC2, PLC3). To study the role and function of these three genes the genes were disrupted and the mutants analysed. CaPLC1 seems to be an essential gene as the disruption of the second allele was unsuccessfully. A conditional mutant showed similar phenotypes to the PLC1-mutant of Saccharomyces cerevisiae. These phenotypes are temperature sensitivity, inhibited growth at osmotic stress and on media with non-glucose carbon source as well as on medium with the nitrogen source arginine. Even the heterozygous ΔCaplc1/CaPLC1 mutant showed altered phenotypes. Additionally the hyphal formation was impaired on some hyphae inducing media. Further the heterozygous mutant was inhibited by nocodazole. As the phenotypes of the CaPLC1-mutant of C. albicans are very similar to the phenotypes of the ScPLC1-mutant it supposed a similar role of CaPLC1 too. A genome-wide transcriptional profiling gave hints for several functions. Especially there is a connection between CaPlc1 function and the transcriptional repressor CaNrg1, which expression increased in the mutant. Against CaPlc1, which has a typical eukaryotic phospholipase C structure, are the nearly identical proteins CaPlc2 and CaPlc3 more similar to the prokaryotic structure of phospholipase C. There is no counterpart in S. cerevisiae but in other Candida-species for CaPlc2 and CaPlc3. both genes are not essential, as double mutants survive and show even hardly altered phenotypes. The double mutants had reduced ability to produce hyphae on some solid media and were as virulent as the wild type in a model of systemic mice infection. The second part of this study concerned a gene, named CaDOA1, as it has homology to the mammalian PLAP (phospholipase A2 activating protein) and to ScDOA1 in S. cerevisiae. It contains WD-repeats and a mellitin-like sequence. In this work was shown that the mellitin-like sequence is necessary for full function of CaDoa1. CaDOA1 was expressed under yeast and hyphae morphologies. The mutant showed an interesting filamentous phenotype and grew as pseudohyphae and true hyphae under conditions which normally support yeast growth. Further the mutants were hypersensitive to various compounds such as propranolol, butanol, caffeine, chelators, azoles, nocodazole and cadmium. Known phenotypes of the homologous ScDOA1-mutant correspond only partly with the CaDOA1-mutant phenotypes, some are contrary. Transcriptional profiling and detected phospholipase activities in an enzyme assay, together with the phenotypes supported the hypothesis that the function of CaDoa1 is associated with Ubiquitin-mediated proteolysis and phospholipase activity.
