Effect of mesenchymal stem cells on coxsackievirus B3-induced inflammatory cardiomyopathy

Abstract

Background - Under current heart failure treatment, the prognosis of dilated cardiomyopathy (DCM) is poor, urging for alternative therapeutic strategies. There is growing experimental support for the application of cellular transplantation as a strategy to improve myocardial function. Mesenchymal stem cells (MSC) have immunomodulatory features and have been experimentally shown to be attractive tools for the treatment of myocardial infarction and cardiomyopathies. Aim - The aim of the present study was to investigate whether MSC are potential candidates for the treatment of CVB3-induced inflammatory DCM. In detail, the study focuses on analyzing whether coxsackievirus B3 (CVB3) replication can take place in MSC and whether CVB3 infection can influence MSC viability. In addition, the study investigates whether and how MSC, independently of their immunomodulatory effects, i.e. in the absence of immunoregulatory cells, can have a direct protective effect on CVB3-induced cardiomyocyte apoptosis and oxidative stress. Methods/experimental design - To study the potential infectivity of MSC, the expression of the coxsackievirus-adenovirus receptor (CAR) and the co-receptor decay accelerating factor (DAF), both necessary for CVB3 uptake, on MSC was evaluated by FACS analysis. Chinese Hamster Ovarian (CHO) cells overexpressing CAR and HL-1 cells, since cardiomyocytes are the target cells of CVB3, were used as positive controls. CHO lacking CAR and cardiac fibroblasts, known to express only low CAR, were used as negative controls. Next, MSC were infected with CVB3 at a multiplicity of infection (m.o.i.) of 5 for 1h. Cell viability was determined 4h, 12h, 24h, and 48h after CVB3 infection via a MTS assay. To assess whether viral replication and viral progeny release take place, the same timeframe experiment was performed and cells and medium were collected to determine CVB3 RNA copy number and plaque formation, respectively. All experiments were performed in parallel with HL-1 and cardiac fibroblasts. To determine the effect of MSC on CVB3-infected HL-1, unlabeled, DiO-labeled or Dil-labeled MSC were cocultured with CVB3-infected HL-1 for RNA purposes, apoptosis (Annexin V/7AAD FACS) and oxidative stress (DCF FACS) analysis, respectively. To investigate whether the MSC-mediated effects are nitric oxide (NO)-dependent, MSC were pretreated with the iNOS inhibitor N-omega-nitro- arginine methyl ester (L-NAME). To determine whether MSC need the presence of IFN- or cell contact with HL-1, culture in the presence of anti-murine IFN- antibody or on a transwell membrane was performed, respectively. To determine whether cell contact per se leads to an improvement in the condition of the HL-1 cells, cocultures of HL-1 cells with cardiac fibroblasts instead of MSC were performed. Medium of coculture experiments was collected to analyze viral titer via plaque formation on HeLa cells. Results - Compared to CHO-CAR+ and HL-1 cells, as well as to CHO-CAR- and cardiac fibroblasts, MSC only minimally express CAR at levels nearly comparable with secondary antibody controls. As for CAR, MSC also only moderately express DAF. CVB3 RNA copy number, expressed as CVB3 towards L32, decreased over time in MSC, with 4.1–fold (p=0.0571) and 7.2–fold (p<0.05) lower levels at 24h and 48h versus 4h post-infection, respectively. In parallel, no differences in cell viability were found between serum starved and CVB3-infected MSC. Medium of MSC collected 24h after CVB3 infection did not induce any plaques on HeLa cells. In contrast, CVB3 RNA copy number rised in HL-1 over time, with 9.0–fold (p<0.01) higher RNA levels at 24h versus 12h post-infection. Compared to serum-starved HL-1 cells, CVB3-infected HL-1 showed gradually more cell death over time post CVB3 infection. MTS assay demonstrated 1.9–fold (p<0.0001), 1.5-fold (p<0.0001) and 1.2–fold (p<0.05) lower cell viability at 48h, 24h and 12h post CVB3-infection versus 4h post CVB3-infection, respectively. In cardiac fibroblasts, CVB3 copy number was 3.9-fold (p=0.05) higher at 48h compared to 4h post CVB3-infection. In parallel, cell viability was significantly decreased in CVB3-infected compared to serum starved cardiac fibroblasts 48h post CVB3 infection. The viral titer of medium collected from cardiac fibroblasts 24h post infection was 28-fold (p<0.05) lower compared to the titer of HL-1 medium. Annexin V/7AAD FACS analysis demonstrated that MSCs decreased the 4.2-fold (p<0.05) CVB3-induced HL-1 apoptosis to levels not significantly different from those of non-infected cells. In parallel, DCF FACS analysis showed that CVB3 induced ROS production in HL-1 cells by 6.3–fold (p<0.01), whereas MSC reduced the increased ROS production by 5.1–fold (p<0.01) to levels not significantly different from those of non-infected controls. When MSCs were pre-treated with 10 mM of L-NAME or cultured in the presence of 1 µg/ml of anti-mouse IFN-γ antibody or cultured on a transwell, the anti-apoptotic and anti-oxidative effects of MSC were abrogated. MSC did not reduce CVB3 RNA copy number in CVB3-infected HL-1 cells, but decreased the viral CVB3 titer by 4.7-fold (p<0.05), an effect which was blocked in the presence of L-NAME or anti-mouse IFN-γ antibody. Co-culture of CVB3-infected HL-1 cells with cardiac fibroblasts aggravated CVB3-induced apoptosis. Conclusion - In conclusion, we could demonstrate that CVB3 replication does not take place in MSC and that MSC do not suffer from CVB3 infection. Besides this important safety aspect, we could show that MSC have a direct protective effect on CVB3-infected HL-1 cells, i.e. in the absence of any immunomodulatory cells. MSC exert anti- apoptotic as well as anti-oxidative effects on CVB3-infected HL-1 cells in a NO-, IFN-γ-, and cell-contact-dependent way. Finally, MSC can reduce the viral progeny release.

Hintergrund: Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie zeigen unter den heute üblichen Behandlungsmöglichkeiten eine schlechte Prognose. Es ist deshalb nötig, alternative Behandlungsmöglichkeiten zu finden. Zahlreiche experimentelle Studien belegen die Eignung der Zelltherapie zur Verbesserung der Herzfunktion. Mesenchymale Stammzellen (MSC) haben immunomodulatorische Eigenschaften und sind eine geeignete Zellquelle für die Behandlung von Herzinfarkt und Kardiomyopathie. Ziel: Das Ziel der vorliegenden Studie war zu untersuchen, ob MSC potentielle Kandidaten zur Behandlung der Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten inflammatorischen dilatativen Kardiomyopathie sind. Die Studie fokussiert sich auf die Untersuchung der Infektion von MSC mit CVB3, der Replikation des CVB3 in MSC und der Viabilität der MSC nach einer Infektion mit CVB3. Außerdem wurde untersucht, ob und wie MSC-unabhängig von ihren immunomodulatorischen Eigenschaften , d.h. in Abwesenheit immunoregulatorischer Zellen – direkte protektive Effekte auf CVB3-infizierte Cardiomyocyten und deren Apoptose und oxidativen Stress haben. Methoden: Um den potenziellen infectivity von MSC, der Ausdruck des coxsackievirus- adenovirus Empfängers (AUTO) und der Co-Empfänger-Zerfall zu studieren, der Faktor (DAF) beschleunigt, wurden beide notwendig für das CVB3 Auffassungsvermögen, auf MSC durch die FACS Analyse bewertet. Chinesischer Hamster (CHO) Eierstockzellen, die AUTO und HL-1 Zellen, seitdem cardiomyocytes überausdrücken, sind die Zielzellen von CVB3, wurde als positive Steuerungen verwendet. CHO fehlendes AUTO und Herzmittel fibroblasts, bekannt, nur niedriges AUTO auszudrücken, wurden als negative Steuerungen verwendet. Dann wurden MSC mit CVB3 an einer Vielfältigkeit der Infektion (m.o.i) angesteckt. 5 für 1.. Zellenlebensfähigkeit war 4., 12., 24., und 48. nach CVB3 Infektion über eine MTS-Feinprobe entschlossen. Um zu bewerten, ob Virenerwiderung und Virennachkommenschaft-Ausgabe stattfinden, wurde dasselbe Zeitrahmen-Experiment durchgeführt, und Zellen und Medium wurden gesammelt, um CVB3 RNS-Kopie-Zahl und Plaque-Bildung beziehungsweise zu bestimmen. Alle Experimente wurden in der Parallele mit HL-1 und Herzmittel fibroblasts durchgeführt. Um die Wirkung von MSC auf CVB3-angestecktem HL-1 zu bestimmen, waren unetikettierte, DiO-etikettierte oder Dil-etikettierte MSC cocultured mit CVB3-angestecktem HL-1 zu RNS-Zwecken, apoptosis (Annexin V/7AAD FACS) und Oxidative-Betonung (DCF FACS) Analyse beziehungsweise. Um nachzuforschen, ob die MSC-vermittelten Wirkungen Stickstoffoxyd (NICHT) - Abhängiger sind, wurden MSC mit dem iNOS Hemmstoff mit N-omega-nitro-arginine Methyl Ester (L-NAME) vorverhandelt. Um zu bestimmen, ob MSC die Anwesenheit von IFN-γoder Zellenkontakt mit HL-1 brauchen, wurde die Kultur in Anwesenheit von anti- murine IFN-γ Antikörper oder auf einer transwell Membran beziehungsweise durchgeführt. Zu bestimmen, ob Zellenkontakt per se zu einer Verbesserung in der Bedingung der HL-1 Zellen, cocultures HL-1 Zellen mit dem Herzmittel fibroblasts statt MSC führt, wurden durchgeführt. Das Medium von Coculture- Experimenten wurde gesammelt, um virentiter über die Plaque-Bildung auf HeLa Zellen zu analysieren. Ergebnisse: Verglichen mit dem CHO-AUTO und HL-1 Zellen, sowie mit dem CHO-AUTO - und Herzmittel fibroblasts drücken MSC nur minimal AUTO an mit sekundären Antikörper-Steuerungen fast vergleichbaren Niveaus aus. Bezüglich des AUTOS drücken MSC auch nur gemäßigt DAF aus. CVB3-RNS kopiert Zahl, ausgedrückt als CVB3 zu L32, vermindert im Laufe der Zeit mit MSC, mit der 4.1 Falte (p=0.0571) und 7.2 Falte (p <0.05) niedrigere Ebenen an 24. und 48. gegen 4. Postinfektion beziehungsweise. In der Parallele wurden keine Unterschiede in der Zellenlebensfähigkeit zwischen dem Serum verhungert und CVB3-angestecktem MSC gefunden. Das Medium von MSC versammelte sich 24., nachdem CVB3 Infektion keine Plaquen auf HeLa Zellen veranlasste. Im Gegensatz, CVB3 RNS-Kopie-Zahl rised in HL-1 im Laufe der Zeit, mit der 9.0 Falte (p <0.01) höhere RNS-Niveaus an 24. gegen 12. Postinfektion. Verglichen mit serum-verhungerten HL-1 Zellen zeigte CVB3-angesteckter HL-1 allmählich, dass mehr Zellentod im Laufe der Zeit CVB3 Infektion anschlägt. MTS-Feinprobe demonstrierte 1.9 Falte (p <0.0001), 1.5 Falte (p <0.0001) und 1.2 Falte (p <0.05) niedrigere Zellenlebensfähigkeit an 48., 24. und 12. Post- CVB3-Infektion gegen 4. Post-CVB3-Infektion beziehungsweise. Im Herzmittel fibroblasts war CVB3 Kopie-Zahl (p=0.05) höher an 48. verglichen mit 4. Post- CVB3-Infektion 3.9-Falten. In der Parallele wurde Zellenlebensfähigkeit in CVB3-angesteckt verglichen mit dem verhungerten Herzmittel des Serums fibroblasts 48. CVB3 Postinfektion bedeutsam vermindert. Der virentiter des Mediums gesammelt vom Herzmittel fibroblasts 24. Postinfektion war (p <0.05) tiefer verglichen mit dem titer des HL-1 Mediums 28-Falten. Annexin V/7AAD FACS Analyse demonstrierte, dass MSCs die 4.2 Falte (p <0.05) CVB3-veranlasster HL-1 apoptosis zu von ''denjenigen von nichtangesteckten Zellen nicht bedeutsam verschiedenen Niveaus verminderte. In der Parallele, DCF FACS Analyse zeigte, dass CVB3 ROS Produktion in HL-1 Zellen durch die 6.3 Falte veranlasste (p <0.01), wohingegen MSC die vergrößerte ROS Produktion durch die 5.1 Falte (p <0.01) zu von ''denjenigen von nichtangesteckten Steuerungen nicht bedeutsam verschiedenen Niveaus reduzierte. Als MSCs mit 10 Mm des L-NAMENS oder kultiviert in Anwesenheit von 1 µ vorverhandelt wurden g/ml der Antimaus IFN-γ Antikörper oder kultiviert auf einem transwell, dem anti-apoptotic und Anti-Oxidative-Wirkungen von MSC wurden abgeschafft. MSC reduzierte CVB3 RNS-Kopie-Zahl in CVB3-angesteckten HL-1 Zellen nicht, aber verminderte den viren-CVB3 titer durch die 4.7 Falte (p <0.05), eine Wirkung, die in Anwesenheit vom L-NAMEN oder Antimaus IFN-γ Antikörper blockiert wurde. Die Company-Kultur von CVB3-angesteckten HL-1 Zellen mit dem Herzmittel fibroblasts erschwerte CVB3-veranlassten apoptosis. Beschluss: Schließlich konnten wir demonstrieren, dass CVB3 Erwiderung in MSC nicht stattfindet, und dass MSC unter CVB3 Infektion nicht leidet. Außer diesem wichtigen Sicherheitsaspekt konnten wir zeigen, dass MSC eine direkte Schutzwirkung CVB3-angesteckte HL-1 Zellen, d. h. ohne irgendwelche immunomodulatory Zellen anhaben. MSC gebrauchen anti-apoptotic sowie Anti-Oxidative-Wirkungen auf CVB3-angesteckte HL-1 Zellen in a NEIN-, IFN-γ-, und zellen-kontakt-abhängigem Weg. Schließlich kann MSC die Virennachkommenschaft-Ausgabe reduzieren.