Klonierung und funktionelle Expression von Enzymen des L-Fucose-Stoffwechsels

Abstract

L-Fucose ist ein wichtiger Monosaccharidbaustein komplexer N- und O-Glycane und Glycolipide von Säugetieren. Sie findet sich in der Regel terminal in den Oligosaccharid-ketten und ist an einer Reihe biologischer Prozesse beteiligt. Die Biosynthese der L-Fucose findet im Cytosol von Zellen statt. Die de novo- Synthese erfolgt über GDP-Mannose. Ein Multienzymkomplex wandelt dabei Mannose in Fucose um. 10% der GDP-Fucose werden jedoch über den sogenannten Salvage Pathway gebildet, der die Fucose aus der Nahrung oder dem Abbau von Glycokonjugaten wiederverwertet. Zwei Enzyme sind an diesem Weg beteiligt, die L-Fucosekinase und die GDP-Fucose-Pyrophosphorylase. In dieser Arbeit wurden die Enzyme des Salvage Pathways der L-Fucose in zwei unterschiedlichen Systemen rekombinant exprimiert. Zum einen wurden die humane Fucokinase und ihre C-terminal lokalisierte Kinasedomäne als GST-Fusionsproteine in E. coli exprimiert. Es war zwar nicht möglich, die komplette GST-Fucokinase in löslicher Form herzustellen, da sämtliches überexprimiertes Protein in Einschlusskörperchen vorlag. Die GST-Fucokinase-Domäne bildete zwar ebenfalls Einschlusskörperchen, ein signifikanter Anteil des Proteins war jedoch löslich und konnte durch Affinitätschromatographie nahezu bis zur Homogenität gereinigt werden. Zusätzlich konnten Einschlusskörperchen der ebenfalls als GST-Fusionsprotein exprimierten Kinasedomäne der murinen Fucokinase durch denaturierende Bedingungen wieder in Lösung gebracht werden. Das zweite verwendete Expressionssystem war das Baculovirus-Expressionssystem, das sich in der Regel gut für die heterologe Expression von Säugerproteinen in Insektenzellen eignet. Allerdings gelang es auch mit dieser Methode nicht, die Fucokinase als lösliches Protein zu exprimieren. Möglicherweise hatte das überexprimierte Protein hier einen toxischen Effekt auf die verwendeten Zellen. Im Gegensatz dazu war die Expression der GDP-Fucose-Pyrophosphorylase in Insektenzellen erfolgreich. Die löslichen Fraktionen der Zellen enthielten bis zu 20% rekombinantes Protein. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Antiseren gegen die humane Fucokinase hergestellt. Da zu Beginn dieser Experimente noch kein rekombinantes Protein vorlag, erfolgte die Immunisierung von Kaninchen mit chemisch synthetisierten Peptiden, die aus Teilsequenzen der Primärstruktur der Fucokinase bestanden. Insgesamt wurden sechs Kaninchen immunisiert, und alle gewonnenen Antiseren waren im Dot-Blot gegen die ausgewählten Peptide reaktiv. Zusätzlich konnten die Antikörper gegen eines der beiden Peptide im Western-Blot die Fucokinase der Ratte identifizieren. Die hier präsentierten Ergebnisse bieten die Voraussetzung für weitere biochemische und immunhistologische Untersuchungen, die die Rolle des Salvage Pathways der Fucose weiter entschlüsseln können.

L-fucose is an important monosaccharide moiety of various complex N- and O-linked glycans and glycolipids produced by mammalian cells. Fucose frequently exists as a terminal modification of oligosaccharide chains and plays an essential role in several biological processes. The biosynthesis of L-fucose takes place in the cytosol of mammalian cells. The de novo pathway uses GDP-mannose as a starting point. A multienzyme complex converts GDP- mannose to GDP-fucose. 10% of GDP-fucose derives from the salvage pathway, which reutilizes fucose from nutritional sources and from the degradation of fucosylated glycans. Two enzymes are involved in this pathway L-fucose kinase and GDP-fucose pyrophosphorylase. In the present study two different systems for the expression of recombinant enzymes involved in the salvage pathway of L-fucose were used. Furthermore, the human fucokinase and their C-terminally located kinase domain itself were expressed as GST fusion proteins in E. coli. It was not possible to overexpress the complete GST-tagged fucokinase as a soluble protein, beceause all of the recombinant protein was found in inclusion bodies. The recombinantly expressed GST fucokinase kinase domain also formed inclusion bodies. However, a significant portion of the protein was soluble and was purified by affinity chromatography almost up to homogeneity. Additionally, inclusion bodies of the expressed murine fucokinase as a GST-tagged protein could be solubilized under denaturating conditions. The second expression system used was the baculovirus expression system, which is appropriate to the heterologous expression of mammalian proteins in insect cells. Nevertheless, the expression of fucokinase as a soluble protein was not successful. It is conceivable that the expressed protein here had a toxic effect on the insect cells. In contrast, the expression of GDP-fucose pyrophosphorylase was successful in insect cells. The soluble fraction of the cells contained up to 20% of recombinant protein. In the second part of this study antiserum against the human fucokinase was generated. At the beginning of these experiments no recombinant proteins were available, and the immunization of rabbits with chemically synthesized peptides was necessary. These peptides consist of sequences of the primary structure of the fucokinase. Altogether six rabbits were immunized, and all attained antisera exhibited a positive reaction in the dot-blot analyses towards the selected peptide. Additionally, one of the two peptides antisera could identify rat fucokinase in the western blot analysis. The results presented here offer the basis for further biochemical and immunohistological investigations, which could decode in more detail the role of the salvage pathway of fucose.