Regulation von Matrixmetalloproteasen, Apoptose und Zellproliferation durch die Cannabinoidrezeptoren CB1 und CB2 in glatten Gefäßmuskelzellen und kardialen H9C2 Zellen

Abstract

Ziel: Cannabinoide üben ihre Wirkung über zwei Cannabinoidrezeptoresubtypen CB1 und CB2 aus. Beide Rezeptoren werden im kardiovaskulären System exprimiert und sind in Pathomechanismen von kardiovaskulären Erkrankungen impliziert. Diese Arbeit setzt sich mit der Wirkung von cannabinoidrezeptorwirksamen Substanzen auf die Matrixmetalloproteasenexkretion in den Zellüberstand von VSMC und kardialen Zellen (H9C2 Zellen) auseinander. Zudem wurde der Einfluss von CB1 und CB2 Agonismus und Antagonismus auf die Apoptose, die Zellproliferation und die Glukoseaufnahme untersucht. Methoden: Untersuchungen fanden mit VSMC und H9C2 Zellen statt. VSMC wurden aus Aorten von Wistar Ratten isoliert. Gegenstand der Untersuchung waren vier cannabinoidwirksame Substanzen, der CB1 Agonist ACEA, der CB1 Antagonist Rimonabant, der CB2 Agonist JWH-133 und der CB2 Antagonist AM 630. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit IL-1α und gleichzeitiger Behandlung mit den cannabinoidwirksamen Substanzen. Die Behandlung erfolgte für 48 Stunden. Zellüberstände wurden für die Zymographien und die Bestimmung der Glukose- und Laktatspeigel sowie der Elektrolyte, Zellpellets für die Proteindiagnostik verwendet. Zudem erfolgten fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Apoptosemarker Caspase-3 und FasL sowie von TGF-β. Zellkernfärbung erfolgte mit Dapi sowie die Untersuchung mittels IncuCyte Caspase-Assay. Die Untersuchung der Zellproliferation erfolgte mittels IncuCyte Imaging. Ergebnisse: Eine Behandlung mit dem CB2 Agonisten führte zu einer Minderung der zytokininduzierten Sekretion von MMP-2, pro-MMP-2 und MMP-9. Es kam zu einer Reduktion der FasL und Caspase-3 vermittelten Apoptose durch CB2 Agonismus sowie zu einer Normalisierung der TGF-β1 Expression. Zusätzlich wurde die IL-1α vermittelte Glukoseaufnahme in die Zelle durch den CB2 Agonisten JWH-133 gemindert. Auch die CB1 Inhibition mit Rimonabant zeigte eine tendenzielle Reduktion der MMP-Level sowie einen antiapoptotischen Effekt in den VSMC, allerdings im geringeren Maße als die CB2 vermittelten Effekte. Diskussion: Zusammenfassend zeigten sich CB2 vermittelte protektive Eigenschaften auf Proteolyse, Apoptose und Glukoseaufnahme in die Zellen. Einen anhaltenden Effekt auf die Zellproliferation konnten wir nicht zeigen. Die Ergebnisse implizieren CB2 als einen interessanten Kandidaten für weitere Untersuchung in kardiovaskulären Krankheitsmodellen, beispielweise der Atherosklerose, der Aneurysmagenese und der diabetischen Vaskulopathie.

Aim: Cannabinoids mediate their effects via the two cannabinoid receptor subtypes CB1 and CB2. Both receptors are expressed in cardiovascular tissue therefore they are implicated in the pathomechanism of cardiovascular disease. The aim of this study was to identify the effect of synthetic cannabinoids (CB1 and CB2 agonists and antagonists) on matrixmetalloproteases in the cell medium of vascular smooth muscle cells (VSMC) and H9C2 cells. Additionally, we investigated the influence of selective CB1 and CB2 agonism and antagonism on apoptosis, cell proliferation and glucose uptake. Methods: Experiments were performed using primary VSMC and H9C2 cells. VSMC were isolated from Wistar rats. The CB1 agonist ACEA, the CB1 antagonist Rimonabant, the CB2 agonist JWH-133 and the CB2 antagonist AM 630 were used to perform the experiments. The stimulation of the cells was performed using IL-1α simultaneously with the treatment of cannabinoid substances. Treatment lasted 48 hours. Afterward cell medium was used for analysis of proteolysis and glucose and lactate levels as well as electrolytes. Cells were used for protein diagnostics. Investigations of apoptosis was performed using fluorescence microscope with cell nuclei staining (DAPI), apoptotic markers for Caspase-3, FasL and TGF-β1 as well as the IncuCyte Caspase-Assay. Cell proliferation was analyzed using IncuCyte live cell imaging. Results: Treatment with CB2 agonist JWH-133 lead to a reduction of cytokine induced levels of MMP-2, MMP-9 and pro-MMP-9 in the cell medium. FasL and Caspase-3 mediated apoptosis was reduced by CB2 agonism in VSMC. Treatment with CB2 agonist JWH-133 additionally normalized TGF-β1 levels. IL-1α induced glucose uptake was mitigated by CB2 stimulation. CB1 inhibition with Rimonabant reduces MMP-levels by tendency while also showing an antiapoptotic effect in the VSMC but in a lesser capacity than the effects mediated via CB2. Discussion: In summary, we could show that CB2 mediates protective properties in relation to proteolysis, apoptosis and glucose uptake into the cells. We could not show a definite effect on cell proliferation via cannabinoid receptors. Our results implicate CB2 as an interesting candidate for further investigation in cardiovascular disease related to regulation of proteolysis such as atherosclerosis, aneurysm formation as well as in models of diabetic vasculopathy.