Methylation landscape in acute myeloid leukemia upon 5-Azacytidine treatment

Abstract

Background: The hypomethylating agent 5-azacytidine (5-AzaC) is the backbone of non-intensive treatment of acute myeloid leukemia (AML) patients, especially in combination with novel targeted therapies such as venetoclax. However, its mechanism of action is still poorly understood, and there are no clear genetic and/or epigenetic markers available that can predict treatment response, therapy resistance, or disease relapse. There have been reports that 5-AzaC is not only incorporated in DNA, affecting the epigenome, but also in RNA, thereby affecting the epitranscriptome. Recently, novel advances in Oxford Nanopore Technologies (ONT) based long-read sequencing of DNA and native RNA molecules without the need for cDNA conversion have made it possible to study epigenetic and epitranscriptomic changes within an unbiased genome-wide approach. Combined with proteomics, an in-depth study of DNA and RNA modification dynamics under 5-AzaC treatment might deliver new insights into the 5-AzaC mechanism of action and provide the basis for improved AML patient stratification strategies. Methods: HL60, KASUMI-1, and K562 cell lines were treated with 5-AzaC, and whole-genome and transcriptome sequencing were performed with ONT. Modification calling was conducted for the calling of 5-methylcytosine (5’-mC, DNA) and N6-methyladenosine (m6A, RNA), respectively. Mass spectrometry (LC-MS) was utilized for the validation of methylation changes, and a proteomics study was conducted using tandem mass tag-based mass spectrometry to evaluate the potential impact of epigenetic and epitranscriptomic changes on protein expression. Results: Using ONT whole genome sequencing, we observed a global decrease in 5’-mC under 5-AzaC treatment in all cell lines. LC-MS confirmed the same degree of methylation change and revealed an increase of 5-hydroxymethylcytosine upon 5-AzaC treatment in all cell lines. DNMT (DNA-methyltransferase) family members showed a decreased expression in all cell lines at the protein, but not the transcriptome level. Genes differentially expressed at the RNA level correlated in part with promoter demethylation, and this subset of genes was enriched in immunity pathways while metabolism pathways suggested a demethylation-independent regulatory manner. Direct RNA sequencing showed hardly any changes in m6A modifications in response to 5-AzaC treatment. In accordance, proteomics did not reveal any significant changes in the expression of messenger RNA methylation regulators. Conclusion: ONT long-read sequencing allowed the in-depth analysis of 5-AzaC treatment-associated effects on the DNA and RNA levels. 5-AzaC functions mainly through DNA demethylation. While a longitudinal analysis of AML primary samples under 5-AzaC treatment and the effects on DNA and RNA levels is ongoing, our cell line-based results provided novel insights and have contributed to the discovery of novel potential markers and pathways of 5-AzaC drug response.

Hintergrund: Der hypomethylierende Wirkstoff 5-Azacytidin (5-AzaC) ist das Rückgrat der nicht intensiven Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML), insbesondere in Kombination mit zielgerichteten Therapien wie Venetoclax. Der Wirkmechanismus ist jedoch noch wenig verstanden und es fehlen eindeutige genetische oder epigenetische Marker zur Vorhersage des Behandlungserfolgs, der Therapieresistenz oder eines Rückfalls. Berichte zeigen, dass 5-AzaC nicht nur in DNA sondern auch in RNA eingebaut warden kann, und so nicht nur das Epigenom sondern auch das Epitrankriptiom beeinflusst werden. Fortschritte in der Oxford Nanopore-Technologie (ONT), die Long-Read-Sequenzierung von DNA und nativer RNA ohne cDNA-Konvertierung ermöglicht, haben epigenetische und epitranskriptomische Studien in einem genomweiten Ansatz ermöglicht. Zusammen mit der Proteomik könnte eine Untersuchung der DNA- und RNA-Modifikationsdynamik unter 5-AzaC neue Einblicke in den Wirkmechanismus geben und die Grundlage für verbesserte Stratifizierungsstrategien für AML-Patienten bilden. Methoden: HL60-, KASUMI-1- und K562-Zelllinien wurden mit 5-AzaC behandelt und die Sequenzierung des gesamten Genoms und Transkriptoms mit ONT durchgeführt und 5-Methylcytosin (5'-mC, DNA) bzw. N6-Methyladenosin (m6A, RNA) Veränderungen detektiert. Massenspektrometrie (LC-MS) wurde zur Validierung der Methylierungsveränderungen eingesetzt, und eine Proteomikstudie mit “Tandem-Mass Tag”-basierter Massenspektrometrie genutzt, um die Auswirkungen epigenetischer und epitranskriptomischer Veränderungen auf die Proteinexpression zu bewerten. Ergebnisse: Die ONT-Genomsequenzierung zeigte eine globale Abnahme von 5’-mC unter 5-AzaC-Behandlung in allen Zelllinien. LC-MS bestätigte diese Methylierungsänderung und zeigte einen Anstieg von 5-Hydroxymethylcytosin nach 5- AzaC-Behandlung. DNMT-Familienmitglieder (DNA-Methyltransferase) zeigten eine verminderte Expression auf Proteinebene, nicht jedoch auf Transkriptomebene. Unterschiedlich exprimierte Gene auf RNA-Ebene korrelierten teilweise mit der Promotor-Demethylierung und waren an Immunitätswegen angereichert, während Stoffwechselwege demethylierungsunabhängig reguliert wurden. Die direkte RNA-Sequenzierung zeigte kaum Veränderungen der m6A-Modifikationen nach 5-AzaC-Behandlung. Entsprechend zeigte die Proteomik keine signifikanten Veränderungen in der Expression von mRNA-Methylierungsregulatoren. Schlussfolgerung: Die ONT-Long-Read-Sequenzierung ermöglichte eine eingehende Analyse der Auswirkungen der 5-AzaC-Behandlung auf DNA- und RNA-Ebene. 5-AzaC wirkt hauptsächlich durch DNA-Demethylierung. Während eine Längsschnittanalyse von AML-Primärproben unter 5-AzaC-Behandlung läuft, lieferten unsere zelllinienbasierten Ergebnisse neue Erkenntnisse und trugen zur Entdeckung neuer potentialler Marker und Signalwege des 5-AzaC-vermittelten Therapieansprechens bei.