This dissertation explores genome editing utilizing Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) associated (Cas) enzymes to achieve efficient, precise and virus-free integration of therapeutic transgenes in primary human T cells. Building on previous endonuclease-mediated gene transfer methods, the discussed studies introduce optimized protocols that enhance efficacy through pharmacological agents that modulate cellular DNA repair mechanisms and inhibit the detection of foreign DNA. This novel approach facilitates the precise and highly efficient integration of Chimeric Antigen Receptor (CAR) transgenes into the T cell receptor alpha constant (TRAC) locus, effectively reprogramming T cell specificity towards disease-relevant molecular targets. In vivo pre-clinical studies demonstrate that TRAC-targeted CD19-CAR T cells exhibit substantial anti-tumor activity in three animal models of B-cell malignancies. In addition to potential advantages in safety, comparative analyses suggest that these cells may offer enhanced efficacy over those produced by conventional len-tiviral gene transfer, although further research is needed to confirm these preliminary findings. Collaboration efforts have expanded the application of this technology, providing a robust framework for the pre-clinical development of targeted T cell therapies. Additionally, the dissertation addresses potential allogeneic applications by combining TRAC-CAR integration for redirecting specificity with disruption of genes essential for Major Histocompatibility Complex expression for abolished immunogen-icity, while minimizing chromosomal aberrations by utilization of Cas enzymes from different evolutionary origins. Rigorous evaluations of off-target activity and genotoxici-ty have affirmed the safety of this methodology. While the findings are pre-clinical, they provide a significant step towards the development of effective and safe non-viral CAR T cell therapies poised for clinical trial exploration and therapeutic application.
Diese Dissertation untersucht Genom-Editierung mittels Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) assoziierten (Cas) Enzymen für die effiziente, präzise und virusfreie Integration von therapeutischen Transgenen in primären menschlichen T-Zellen. Auf vorherigen Methoden des Endonuklease-vermittelten Gentransfers aufbauend stellen die diskutierten Studien optimierte Protokolle vor, die durch den Einsatz pharmakologischer Wirkstoffe weiter verbessert wurden. Diese modulieren zelluläre DNA-Reparaturmechanismen und unterdrücken die Erkennung fremder DNA. Dieser Ansatz ermöglicht die präzise und hocheffiziente Integration von chimären Antigen-Rezeptor (CAR)-Transgenen in das T cell receptor constant (TRAC) Gen, wodurch T-Zellen neu programmiert werden können, um krankheitsrelevante molekulare Ziele zu erkennen. Präklinische in vivo Studien zeigen eine robuste Antitumoraktivität von TRAC-integrierten CD19-CAR T-Zellen in drei Tiermodellen für B-Zell-Malignome. Zusätzlich zu vermuteten Sicherheitsvorteilen legen vergleichende Analysen nahe, dass diese Zellen möglicherweise eine höhere Wirksamkeit als konventionell hergestellte, lentiviral transduzierte CAR-T-Zellen haben, wobei weitere Forschung notwendig ist, um diese ersten Ergebnisse zu bestätigen. In einer Kollaboration wurde die Anwendung dieser Technologie für eine weitere molekulare Zielstruktur erweitert. Hier erwies sich die Methode als solides Grundgerüst für die präklinische Entwicklung von neuen T-Zell-Therapien. Die Dissertation erörtert auch die Anwendungsmöglichkeiten in der allogenen Therapie durch die Kombination von TRAC-CAR Integration (zur Umlenkung der T-Zell Spezifität) mit Knockout von Genen, welche essentiell für die Expression von Haupthistokompatibilitäts-Komplex (MHC) Proteinen sind (zur Minimierung der Immunogenität). Chromosomale Aberrationen werden hierbei durch die Nutzung von Cas-Enzymen mit unterschiedlichem evolutionärem Ursprung minimiert. Umfassende Untersuchungen zur Off-Target-Aktivität und Genotoxizität tragen zur Bestätigung der Sicherheit dieser Methode bei. Obgleich die Ergebnisse noch präklinisch sind, stellen sie einen bedeutenden Schritt zur Entwicklung von sicheren und effektiven virusfrei hergestellten CAR-T-Zell-Therapien dar, die für klinische Studien und zukünftige therapeutische Anwendungen geeignet sind.
