Experimental and Data Analytical Optimization of Time-Resolved Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Mechanism of Photosynthetic Water Oxidation

Abstract

Responsible for the oxygen content of the Earth's atmosphere, oxygenic photosynthesis is the key to the evolution of complex life on the planet. In the protein complex photosystem II (PSII) found in plants, algae and cyanobacteria, water molecules are split to release protons and electrons for use in the eventual production of chemical-energy storage compounds such as ATP, NADPH and, further downstream, sugars; molecular oxygen O2 is released as a side-product. The reaction proceeds at a protein-bound metal-oxo cluster (Mn4CaOx), during a multi-photon absorption cycle in which the oxidation state of the cluster passes through so-called S-states. Infrared (IR) absorption spectroscopy can map S-state-induced electrostatic, chemical or structural changes through characteristic absorption bands assignable to amino acids and other molecular groups.

This thesis describes three infrared spectroscopic methodologies performed on plant and cyanobacterial PSII to gather information on the changes in the transitions between S-states by time-resolved mid-IR spectroscopy. The main project applied new analysis approaches to a step-scan Fourier-transform IR (FTIR) data set that had been previously recorded on PSII membrane particles from spinach. The improved data analysis provided the first clear evidence of the chemical nature of the critical and little understood reaction intermediates (termed the S´3 and S4 states) formed before O2 release. In concert with computational simulations, a detailed atomistic scheme of the S3 -> S4 transition is proposed.

A second part of this thesis documents the design, construction, and programming of a spectrometer to apply the rapid-scan FTIR method with a time resolution of <10 ms to spinach PS II membrane particles. Here, it was possible to record IR spectra, which show the temporal workings of processes associated with the electron transport chain on the acceptor side of PSII in a functioning system. Additionally, experiments on spinach PSII treated with the water-analogue ammonia NH3 provided further insight into the complicated interactions between the Mn4CaOx cluster and its protein environment.

The third part of the thesis explored an instrumental approach utilizing tunable continuous wave quantum cascade IR lasers to record IR absorption changes with <50 ns temporal resolution. Reported herein is a comparison of wild-type and PsbA-Val185Asn mutant samples, of the Synechocystis sp. PCC6803 cyanobacterium, measured at wavenumbers that demonstrate behavior attributable to processes occurring at the Mn4CaOx cluster. It was observed that this mutation alters not only the rate of oxygen production, but also slows the formation of the S2 and S`3 states. These results are put into context with an extensive literature review of similar mutants in order to unravel the cause of several common features in their FTIR spectra. As a conclusion, this thesis demonstrates that new insights into PSII and its catalytic cycle, with an emphasis on the S`3 and S4 states, can be obtained by IR spectroscopy, but also that this requires a multitude of experimental, analytical and computational approaches.

Die oxygene Photosynthese ist verantwortlich für den Sauerstoffgehalt der Erdatmosphäre und ist somit der Schlüssel zur Evolution komplexen Lebens. Der Proteinkomplex Photosystem II (PSII), der in Pflanzen, Algen und Cyanobakterien vorkommt, spaltet Wassermoleküle, um Protonen und Elektronen freizusetzen, die für die nachgeschaltete Produktion von chemischen Energiespeichermolekülen wie ATP, NADPH und letztlich Zucker benötigt werden. Hierbei wird als Nebenprodukt molekularer Sauerstoff (O2) freigesetzt.

Die Wasserspaltung findet an einem proteingebundenen Metall-Oxo-Cluster (Mn4CaOx) statt, dessen Oxidationszustand sich während eines Multi-Photonen-Absorptionszyklus schrittweise verändert; die verschiedenen Oxidationszustände werden durch sogenannte S-Zustände beschrieben. Infrarot(IR)-Absorptionsspektroskopie kann S-Zustand-induzierte elektrostatische, chemische oder strukturelle Veränderungen durch charakteristische Absorptionsbänder erfassen, die Aminosäuren und anderen Molekülgruppen zugeordnet werden können.

Im Kontext dieser Dissertation wurden drei IR Methoden an PSII aus Pflanzen und Cyanobakterien angewandt, um Informationen über die S-Zustandsübergänge mittels zeitaufgelöster Mid-IR-Spektroskopie zu erlangen. Das Hauptprojekt wandte neue Analyseansätze auf einen Step-Scan-Fourier-Transform-IR(FTIR)-Datensatz an, der bereits zuvor an PSII-Membranpartikeln aus Spinat aufgezeichnet wurde. Die verbesserte Datenanalyse lieferte den ersten klaren Nachweis der chemischen Natur kritischer und bisher wenig verstandener Reaktionszwischenstufen (den S`3- und S4}-Zuständen), die vor der O2-Freisetzung gebildet werden. In Kombination mit computergestützten Simulationen wird ein detailliertes atomistisches Reaktionsmodell für den S3->S0 Übergang vorgeschlagen.

Der zweite Teil dieser Dissertation dokumentiert den Entwurf, den Aufbau und die Programmierung eines Spektrometers zur Anwendung der Rapid-Scan-FTIR-Methode mit einer Zeitauflösung von unter 10 ms an PSII-Membranpartikeln aus Spinat. Es wurden erfolgreich zeitaufgelöste IR-Spektren funktioneller PSII-Proben aufgezeichnet, die die Prozesse der Akzeptorseite der Elektronentransportkette klar darstellen. Darüber hinaus lieferten Experimente an einer Spinat-PSII Probe, die mit dem Wasseranalogon Ammoniak behandelt wurde, weitere Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Mn4CaOx-Cluster und seiner Proteinumgebung.

Im dritten Teil der Dissertation wurde ein instrumenteller Ansatz angewandt, der kontinuierlich abstimmbare Quantenkaskaden-IR-Laser verwendet, um IR-Absorptionsänderungen mit einer zeitlichen Auflösung von unter 50 ns aufzuzeichnen. Hier wird ein Vergleich von Wildtyp- und PsbA-Val185Asn-Mutante des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 vorgestellt, gemessen bei Wellenzahlen, die Prozessen des Mn4CaOx-Cluster zugeordnet werden können. Es wurde beobachtet, dass diese Mutation nicht nur die Sauerstoffproduktionsrate verändert, sondern auch die Bildung der S2- und S`3-Zustände verlangsamt. Diese Ergebnisse werden im Kontext einer umfassenden Literaturübersicht zu ähnlichen Mutanten diskutiert, um die Ursache mehrerer auffälligen Gemeinsamkeiten zwischen FTIR-Spektren dieser Proben.

Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass durch IR-Spektroskopie neue Einblicke in PSII und seinen katalytischen Zyklus, insbesondere in die S`3- und S4-Zustände, gewonnen werden können. Gleichzeitig wird jedoch deutlich, dass dies ein Zusammenspiel einer Vielzahl an experimentellen, analytischen und computergestützten Ansätzen erfordert.