Establishment of gene therapy using CRISPR-mediated gene editing for X-linked chronic granulomatous disease in hematopoietic stem cells

Abstract

Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare primary immunodeficiency affecting one in 250,000 individuals, caused by defects in genes encoding the NADPH oxidase (NOX) complex in phagocytes. X-linked CGD (X-CGD) results from mutations in the CYBB gene encoding the gp91phox subunit, impairing the generation of superoxide required for pathogen elimination. Current treatments include lifelong antimicrobial prophylaxis, interferon-gamma therapy, corticosteroids, and, occasionally, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), though their limitations necessitate new therapeutic strategies. Gene therapy is a promising approach for monogenic diseases like X-CGD, with hematopoietic stem cells (HSCs) offering an ideal target due to their differentiation capacity. However, limited HSC availability and expansion efficiency pose challenges. Mouse models with patient-derived mutations provide an unlimited HSC source for optimizing gene therapy techniques. This study characterizes the first X-CGD mouse model carrying a patient-derived mutation, replicating disease symptoms and phenotype. A CRISPR/Cas9 homology-directed repair (HDR) strategy was developed to correct the Cybb gene mutation, validated through genomic, protein expression, and functional analyses, together with an off-target assessment confirming the specificity and safety of the gene-editing approach. Additionally, the study explored HIROS (homology-independent replacement of sequence) for Cybb gene correction, offering insights despite suboptimal efficiency at the targeted locus in HSCs. These findings contribute to advancing HSC gene therapy. In conclusion, this work deepens the understanding of X-CGD, establishes a mouse model carrying a patient-derived mutation, and develops gene correction strategies, providing a foundation for future therapeutic interventions targeting genetic disorders in hematopoietic stem cells.

Die chronische Granulomatose (CGD) ist eine seltene primäre Immunschwäche, die etwa eine von 250.000 Personen betrifft und durch Defekte in den Genen verursacht wird, die für den NADPH-Oxidase-Komplex (NOX) in Phagozyten kodieren. Die X-chromosomale CGD (X-CGD) entsteht durch Mutationen im CYBB-Gen, das die gp91phox-Untereinheit codiert, wodurch die Erzeugung von Superoxid, das für die Eliminierung von Pathogenen erforderlich ist, beeinträchtigt wird. Derzeitige Behandlungsansätze umfassen eine lebenslange antimikrobielle Prophylaxe, eine Therapie mit Interferon-Gamma, Kortikosteroide sowie gelegentlich eine hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT), wobei deren Einschränkungen neue therapeutische Strategien erforderlich machen. Die Gentherapie stellt einen vielversprechenden Ansatz für monogene Erkrankungen wie X-CGD dar, wobei hämatopoetische Stammzellen (HSCs) aufgrund ihrer Differenzierungsfähigkeit ein ideales Ziel darstellen. Die begrenzte Verfügbarkeit und die ineffiziente Expansion von HSCs stellen jedoch Herausforderungen dar. Mausmodelle mit patientenabgeleiteten Mutationen bieten eine unbegrenzte Quelle von HSCs zur Optimierung gentherapeutischer Verfahren. Diese Studie charakterisiert das erste X-CGD-Mausmodell mit einer patientenabgeleiteten Mutation, das Krankheitssymptome und Phänotyp repliziert. Eine CRISPR/Cas9-Homologie-gesteuerte Reparaturstrategie (HDR) wurde entwickelt, um die Mutation im Cybb-Gen zu korrigieren, was durch genomische, Proteinexpressions- und funktionelle Analysen validiert wurde, zusammen mit einer Off-Target-Analyse, die die Spezifität und Sicherheit des Genom-Editieransatzes bestätigte. Zusätzlich wurde die HIROS-Methode (homologieunabhängiger Sequenzaustausch) zur Korrektur der Cybb-Genmutation untersucht, wobei trotz suboptimaler Effizienz am Zielort in HSCs wertvolle Einblicke gewonnen wurden. Diese Erkenntnisse tragen zur Weiterentwicklung der HSC-Gentherapie bei. Abschließend vertieft diese Arbeit das Verständnis von X-CGD, etabliert ein Mausmodell mit einer patientenabgeleiteten Mutation und entwickelt Strategien zur Genkorrektur, die eine Grundlage für zukünftige therapeutische Interventionen bei genetischen Erkrankungen in hämatopoetischen Stammzellen bieten.