Untersuchungen zur Introgression von Resistenzen gegen die Wurzelhals- und Stengelfäule [Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et De Not.] aus verwandten Arten in den Raps (Brassica napus L.)

Abstract

Zur Erschließung neuer Resistenzquellen für den Raps (Brassica napus) gegen seinen bedeutendsten pilzlichen Schaderreger, Leptosphaeria maculans (Phoma lingam), wurden Rückkreuzungsnachkommenschaften aus den Hybriden B. napus x Coincya monensis und B. napus x Sinapis arvensis sowie dihaploide (DH) B. napus-B. juncea-Linien (putative Rekombinationslinien) untersucht. Im Laufe des Projektes wurden aus aneuploiden, z. T. sterilen Individuen früher Rückkreuzungsgenerationen mit einem hohen Anteil an Fremdchromatin eine Vielzahl euploider, resistenter, fertiler Pflanzen mit Raps-Karyotyp (2n=38) und Raps-Habitus entwickelt. Dieser Fortschritt wird bei den B. napus-C. monensis-Linien besonders anschaulich. Das Resistenzverhalten des Pflanzenmaterials wurde in verschiedenen Umwelten (Gewächshaus, Klimakammer, Feld) und Entwicklungsstadien sowie gegenüber zwei aggressiven (Tox+) Isolaten des Pilzes, W4 aus Deutschland und M1 aus Australien, geprüft. Vom Isolat M1 war bekannt, daß es die Resistenz der Brassica-Arten mit dem B-Genom durchbricht. Beide hier verwendeten Isolate konnten aufgrund ihrer kompatiblen Interaktion mit Differentialrapssorten in Kotyledonentests der Pathogenitätsgruppe (PG) der aggressivsten Isolate, PG 4, zugeordnet werden. Als Methode der Wahl zur genauen und vergleichenden Einschätzung des Resistenzniveaus im Kotyledonen- und im Adultstadium der Pflanze wurde der Test mit Doppelinokulation für das Gewächshaus entwickelt und optimiert. Hierbei erfolgt zunächst eine Inokulation an den Keimblättern, später zusätzlich an der Stengelbasis. Dieser ist allen anderen Untersuchungen an der adulten Pflanze (Adulttest an kotyledoneninokulierten Pflanzen, Stengelbasistest, Feldversuch) hinsichtlich seiner Trennschärfe zwischen resistenten und anfälligen Individuen überlegen und bewirkte eine verstärkte Symptomausprägung bei anfälligen oder nur moderat-resistenten Genotypen. Durch diesen Test werden umweltabhängige Schwankungen in der Symptomausprägung weitgehend nivelliert. Er ist daher für Studien zur Genetik der Resistenz besonders geeignet. Die Genomische in situ-Hybridisierung (GISH) ist eine geeignete Methode zur Detektion von Fremdchromatin in interspezifischen Hybriden und davon abgeleiteten Rückkreuzungsnachkommen, obwohl mögliche Einschränkungen bei der Gattung Brassica und bei verwandten Gattungen - bei geringer Größe der Introgressionen und/oder Lokalisierung in den distalen Bereichen der Chromosomenarme - beachtet werden müssen. Mit Hilfe von GISH konnten in den B. napus-S. arvensis- und B. napus-C. monensis-Linien monosome und doppelt monosome Additionslinien identifiziert werden. Die Präsenz eines acrocentrischen Additionschromosoms von S. arvensis war stets mit Adultresistenz der Pflanze verbunden. GISH-Untersuchungen an meiotischen Zellen gaben Hinweise auf eine Paarung dieses Chromosoms mit Rapschromosomen (allosyndetische Paarung). Dieses wahrscheinlich resistenzrelevante Additionschromosom zeichnete sich ferner durch eine hohe Transmissionsrate aus. Darüber hinaus wurden in beiden Gruppen resistente Individuen mit Raps- Karyotyp (2n=38) aber ohne GISH-Signale gefunden (putative Rekombinationslinien). Die in einigen Pflanzen detektierten kleinen Signale dürften eher auf Artefakten als auf Introgressionen beruhen. Gleiches gilt für die B. napus-B. juncea-Linien, bei denen adultresistente DH-Pflanzen mit 2n=38 bereits am Anfang der Untersuchungen standen. Die zunehmende cytologische Stabilität in sukzessiven Generationen der B. napus-C. monensis- und B. napus-S. arvensis-Linien konnte anhand der Abnahme von Mixoploidien und irregulären Meiosen demonstriert werden. Diese Abnahmen korrespondieren mit der Extrachromatinreduktion. Adultresistenz in den B. napus-C. monensis- und B. napus-S. arvensis-Linien wird in größerem Maße vererbt als Kotyledonenresistenz, beide beruhen auf unterschiedlichen Genen. Kotyledonenresistenz/-anfälligkeit ist somit kein geeigneter Indikator für Adultresistenz/-anfälligkeit. Erbganganalysen am Resistenzdonor C. monensis (Kotyledonenresistenz) bzw. den B. napus-C. monensis-Rückkreuzungsnachkommen (Adultresistenz) zeigten, daß jeweils zwei Gene an der Ausprägung der Resistenzen beteiligt sind. Am Ende der Untersuchungen konnten B. napus-C. monensis-Linien mit monogen-dominanter Adultresistenz identifiziert werden. In der Gruppe mit Resistenzen aus S. arvensis wird Adultresistenz wahrscheinlich ebenfalls oligogen vererbt. Studien zur Resistenzgenetik dieser Gruppe wurden jedoch durch die lediglich moderate Adultanfälligkeit des Rückkreuzungselters, B. napus "Ceres", erschwert. Diese Rapssorte leitet sich von der Sorte "Jet Neuf" ab, die sich durch eine moderate, partielle und polygen bedingte Adultresistenz auszeichnet. Die B. napus-S. arvensis-Linien dürften andererseits von besonderem praktischen Wert sein. Sie vereinen in sich die mono- bzw. oligogene, vertikale Resistenz der Wildart mit der polygenen, horizontalen Resistenz des Rapses gemäß dem modernen Züchtungskonzept der Pyramidisierung von Resistenzgenen. Inwieweit die Kotyledonenresistenz in den B. napus-S. arvensis-Linien auf dem erwarteten mono- oder oligogene Erbgang beruht, konnte nicht geklärt werden. Hierzu trug die festgestellte Temperaturabhängigkeit dieser Resistenz bei. Während die Kotyledonenresistenz einiger Linien gegenüber dem Isolat W4 mit steigenden Temperaturen verloren ging, war die Situation im Falle von M1 umgekehrt. Die vergleichende Analyse der Virulenz der Isolate W4 und M1 erbrachte für die B. napus-C. monensis- bzw. B. napus-S. arvensis-Nachkommenschaften keine wesentlichen Unterschiede in der Resistenz der adulten Pflanze. Anders war die Situation bei den B. napus-B. juncea-Linien. Diese gegenüber beiden Isolaten kotyledonenanfälligen Linien zeigten nach W4-Inokulation den erwarteten monogen-dominanten Erbgang für Adultresistenz. Zu den überraschendsten Ergebnissen zählte demgegenüber die Adultresistenz verschiedener B. napus-B. juncea-DH-Linien gegenüber dem Isolat M1 trotz zweier anfälliger Eltern der Originalkreuzung (B. napus "Liropa", B. juncea). Zur Klärung der zugrundeliegenden Resistenzgenetik erfolgten Untersuchungen an Nachkommenschaften aus Kreuzungen zwischen resistenten und anfälligen DH-Pflanzen (DH-F1) sowie aus interspezifischen Kreuzungen aus DH-F1-Pflanzen und B. juncea. Die Ergebnisse zeigten, daß die monogene Vererbung durch ein epistatisches Gen modifiziert wird. An Selbstungsnachkommen aneuploider (eine B. napus-C. monensis-Linie) und putativ rekombinanter Pflanzen mit 2n=38 (eine B. napus-C. monensis- und eine B. napus-S. arvensis-Linie) wurde mittels bulk segregant analysis versucht, RAPD- PCR-Marker für Adultresistenz zu finden. Diese Suche blieb erfolglos. Dafür dürften die mangelnde Reproduzierbarkeit dieser Technik, die weiträumige Verteilung der RAPD-Marker in den Genomen, ein zu geringer Stichprobenumfang getesteter Primer und genetische Gründe (z. T. mehr als ein Resistenzgen) verantwortlich sein. Die Adultresistenzen aus S. arvensis und C. monensis sind als wertvolle Alternativen zu bisherigen kommerziellen und wissenschaftlichen Resistenzquellen (B. napus "Jet Neuf", Brassica-B-Genom) anzusehen, wie das Interesse von Pflanzenzuchtunternehmen zeigt. Aufgrund der politisch bedingten Limitierung des Anbaus transgener Pflanzen in weiten Teilen der Welt dürfte die Bedeutung interspezifischer Hybridisierungen für die Pflanzenzüchtung zunehmen.

Blackleg caused by Leptosphaeria maculans (Phoma lingam) is the most significant disease affecting oilseed rape (Brassica napus) worldwide. Wild crucifers and related species of the Brassicaceae family are known to be potential resistance sources. Therefore backcross offspring from intergeneric hybrids between B. napus x C. monensis (spring material) and B. napus x S. arvensis as well as B. napus-B. juncea dihaploid (DH) putative recombination lines (both groups: winter material) were examined according to their blackleg resistence behaviour. The progression from aneuploid (in some cases sterile) individuals from early backcross generations, with a high level of alien chromatin, to fertile euploid plants with B. napus karyotype (2n=38) and B. napus habitus, but still exhibiting resistance to blackleg, is presented for the first two groups. This progress is shown best for the B. napus-C. monensis lines. The plant material was examined in different environments (greenhouse, growth chamber, field) with respect to its resistance response to two aggressive (Tox+) isolates of the fungus, namely W4 from Germany and M1 from Australia. The latter was known to overcome the Brassica B genome resistance. Both isolates could be classified as PG (pathogenicity group) 4 isolates according to their compatible interaction in cotyledon tests with all three differential oilseed rape cultivars. A test with double inoculation, performed in the greenhouse, is the method of choice for accurate evaluation of plant resistance levels, both at the seedling and adult plant stages. In this test an early inoculation of the cotyledon is followed by a later inoculation at the stem base. This test strategy was found to be superior to all other adult plant examinations (adult plant test on only cotyledon inoculated plants, stem base test, field test) because it allowed easier differentiation between resistant and susceptible individuals. Because environmental variation in symptom expression is reduced the test is especially appropriate for the study of resistance genetics. Genomic in situ hybridisation (GISH) is a powerful tool for the detection of alien chromatin in interspecific hybrids and backcross offspring derived from them, although possible limitations in Brassica and related genera - due to small sizes of introgressions and/or their location on the distal parts of the chromosome arms - have to be considered. With GISH monosomic and double monosomic additions of C. monensis and S. arvensis chromosomes, respectively, could be identified in the B. napus background. The presence of an acrocentric addition chromosome from S. arvensis was always associated with adult plant resistance. Meiotic cells subjected to GISH gave evidence for an allosyndetic pairing of this chromosome with B. napus chromosomes. This is in agreement with a relatively high transmission rate observed for this chromosome. Furthermore, plants with a B. napus karyotype (2n=38) and no visible GISH signals, representing putative recombination lines, were obtained in both groups. In some cases plants showed small signals, however these signals were presumed to be hybridisation artefacts rather than introgressions. The same applies to selected B. napus-B. juncea backcross offspring. In the B. napus-C. monensis and B. napus-S. arvensis lines increased cytological stability in subsequent backcross generations could be demonstrated by a decrease in both, mixoploidies and irregular meioses. These decreases correspond with a reduction of alien chromatin. In the lines derived from S. arvensis or C. monensis adult plant resistance is inherited more readily than cotyledon resistance. These traits are conferred by different loci, which is why cotyledon resistance/susceptibility is not a suitable indicator for adult plant resistance/susceptibility. Two genes were identified conferring adult plant resistance in the B. napus-C. monensis lines, while cotyledon resistance in C. monensis is due to two other genes. Finally, B. napus-C. monensis lines were selected that displayed adult plant resistance conferred by a single major gene. In the group with resistances from S. arvensis adult plant resistance is probably also inherited oligogenically. Studies of resistance genetics in these lines are influenced by the backcross parent, B. napus "Ceres", which has only a moderate adult plant susceptibility. This cultivar contains genes from B. napus "Jet Neuf", which possesses moderate partial polygenic adult plant resistance. On the other hand, these lines could be of special practical value because they combine the mono- or oligogenic, vertical resistance from the wild species with the polygenic horizontal B. napus resistance following the modern breeding concept of pyrimidising resistance genes. Cotyledon resistance, with an expected mono- or oligogenic inheritance, could not be studied in detail, however a temperature dependence was detected in some of the investigated lines. Higher temperatures led to the loss of cotyledon resistance to isolate W4, whereas in the case of the Australian isolate M1 the opposite was observed. Comparative analysis of the virulence of isolates W4 and M1 did not reveal significant differences in adult plant resistance behaviour in the B. napus-C. monensis or in the B. napus-S. arvensis lines. In the B. napus-B. juncea lines - cotyledon susceptible to both isolates - adult plant resistance to isolate W4 was found to be inherited by a dominant gene. In the case of M1 adult plant resistance was surprisingly detected in several B. napus-B. juncea lines, even though the parents in the original cross, B. napus �Liropa� and B. juncea, were both susceptible. Results from offspring from crosses between resistant and susceptible DH plants (DH-F1) as well as from interspecific crosses between DH-F1 plants and B. juncea revealed that the monogenic inheritance of adult plant resistance to M1 is modified by an additional epistatic gene. RAPD-PCR examinations using bulk segregant analysis were applied to selfing progenies from aneuploid (one B. napus-C. monensis line) and putative recombinant plants with 2n=38 (one B. napus-C. monensis and one B. napus-S. arvensis line) to find markers for adult plant resistance. The failure of these attempts was probably caused by the low reproducability of the RAPD technique, the wide distribution of RAPD markers in the genomes, too few primers tested and genetic reasons (in some cases more than one resistance gene was present in the lines). Adult plant resistances from C. monensis and S. arvensis in particular are considered to be valuable alternatives to current commercial and scientific sources of blackleg resistance for rapeseed breeding (B. napus "Jet Neuf", Brassica B genome) as indicated by the interest of breeding companies in this material. Since, in wide parts of the world, e.g. in Europe, GM crops could not be grown commercially due to political reasons, the importance of interspecific trait transfer for plant breeding is assumed to increase in the next years.