Herstellung und Optimierung von Virosomen als Vektoren zur Einschleusung von Transgenen in Bullenspermien

Abstract

Das Ziel vieler Studien ist die Generierung transgener Nutztiere. Für den Transfer der Fremd-DNA in die Eizelle wird hauptsächlich die Mikroinjektion angewendet. So gewonnene Embryonen werden in Leihmütter transferiert, jedoch entwickeln sich beim Rind nur aus ca. 1% der Embryonen ein lebendes, gesundes Kalb. Um die geringe Effizienz zu steigern, wurden andere Techniken entwickelt, unter anderem der Spermien-vermittelte Gentransfer (SMGT). Hierbei handelt es sich um eine Technik, bei der im einfachsten Fall durch Inkubation der Spermien mit DNA-haltigen Medien diese die fremde DNA bei der Befruchtung in die Eizellen tragen. Vorteile dieser Methode sind der geringe apparative Aufwand und die Tatsache, dass Gewinnung und Aufbewahrung der Spermien von Nutztieren gut etabliert sind. Der Transfer von DNA in Zellen ist auf unterschiedlichen Wegen möglich, unter anderem durch Verwendung von Viren. Hierbei wird das natürliche Potenzial der Viren ausgenützt, ihr Genom in Zellen einzuschleusen und sich dort zu replizieren. In der vorliegenden Arbeit wird über die Herstellung von fusogenen Vesikeln berichtet, die in ihrer künstlichen Lipidhülle das Oberflächenprotein des Influenza Virus, Influenzahämagglutinin, tragen. Um die Virosomen zu optimieren, wurden verschiedene Schritte während des Rekonstitutionsprotokolls variiert und die Virosomen im Hinblick auf Lipid-, Protein- und DNA-Gehalt bewertet, sowie die Fusion der Virosomen mit kryokonservierten Bullenspermien und die Gentransferrate beurteilt. Es konnte festgestellt werden, dass in den so hergestellten Virosomen nahezu ausschließlich Influenzahämagglutinin enthalten ist, dass der Hauptteil der Lipide in den Virosomen wiedergefunden werden kann und dass eine Zugabe von 6 mg Cholesterol auf 25,15 mg Gesamtlipid notwendig ist für die Fusion der Virosomen mit den Spermien. Werden Virosomen für verschiedene Zelltypen präpariert, scheint es notwendig zu sein, den Cholesterolgehalt der exogenen Lipide speziell auf die Zellart abzustimmen. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass die so hergestellten Virosomen in der Lage sind, unabhängig vom Individuum, dem Reifestadium der Spermien oder der Spezies des Donorss mit Spermien zu fusionieren. Die Gentransferrate variiert zwischen 1,5 und 302 Plasmiden pro Spermienzelle. Zusammenfassend ist zu sagen, dass Influenzavirosomen eine Alternative bei der Generierung landwirtschaftlicher Nutztiere sein könnten.

Generating transgenic livestock is the aim of many studies. To transfer foreign DNA into oocytes usually pronuclear microinjection is applied. Embryos extracted by this technique are transferred into foster mothers, but only 1% of transferred zygotes results in the birth of living, healthy calves. To improve the efficiency new methods have been developed, among others sperm mediated gene transfer (SMGT). By this technique sperm cells, incubated with DNA containing media, carry the transgene into the oocyte during fertilization. Several methods have been published to transfer foreign genes into living cells. One method is to utilize the natural potential of viruses to transfer and replicate their genetic material into cells. Here experiments are reported that were designed to exploit the fusion potential of reconstituted influenza virus envelopes (virosomes) for the transfer of foreign DNA into bovine spermatozoa. A protocol was developed for the preparation of virosomes bearing influenza X-31 hemagglutinin inserted into artificial lipid bilayers. To optimize virosomes for the sperm mediated transfer different steps during the reconstitution protocol were varied. Criteria for improving the virosomes were beside lipid, protein and plasmid content of virosomes also fusion and gene transfer efficiency to sperm cells. Results of this study indicated that the protein inserted into the lipid bilayers consists mainly of influenza hemagglutinin. From the added lipids the major amount could be found in the virosomes. Interestingly adding about 6 mg cholesterol to a total amount of lipids from 25.15 mg seems to be necessary to promote fusion with cryopreserved bull spermatozoa. But the optimal lipid mixture seems to depend on the target cell. Additionally virosomes are able to fuse to sperm cells independent from individuum, developmental stage or species. Gene transfer to sperm cells varies from 1.5 to 302 plasmids per sperm cell. Taken together this makes virosomes a promising tool for transfering foreign DNA into sperm cells of farm animals.