Charakterisierung des kardialen Phänotyps SERCA2a-transgener Ratten

Abstract

Störungen der zellulären Ca2+-Regulation im Myokard sind für diastolische und systolische Funktionsstörungen bei Herzmuskelhypertrophie und -insuffizienz von wesentlicher pathophysiologischer Bedeutung. Krankheitsbedingte Veränderungen des SERCA2a-katalysierten Transportes von Ca2+ in das sarkoplasmatische Retikulum haben sich dabei als besonders bedeutungsvoll erwiesen. Deshalb wird intensiv nach geeigneten Interventionen zur Verbesserung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) gesucht. Für experimentelle Fragestellungen sind transgene Tiere mit permanenter oder induzierbarer kardialer SERCA2-Überexpression sehr gut geeignete Modelle, an denen zusätzlich eine experimentelle Herzinsuffizienz induziert werden kann. Fundierte Untersuchungen an diesen Modellen verlangen jedoch eine präzise Charakterisierung des kardialen Phänotyps unter physiologischen Bedingungen. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, den kardialen Phänotyp SERCA2-transgener Ratten (TG) mit Expression eines SERCA2-Transgens unter der Kontrolle eines hCMV-Enhancers/ß-Aktin-Promotors unter physiologischen Bedingungen zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das Genom der untersuchten heterozygoten TG 16 Kopien des SERCA2-Transgens enthält. Das Transgen wurde kardial transkribiert. Die linksventrikuläre SERCA2-Überexpression betrug auf mRNA- und Proteinebene +50% bzw. +20%. Das SERCA2-Transgen wurde auch im Vorhofmyokard exprimiert. In linksventrikulären Homogenaten von männlichen und weiblichen TG wurde eine Erhöhung der Ca2+-Transportaktivität des SR um bis zu +49% nachgewiesen. Die Ca2+-Affinität des retikulären Ca2+-Transportsystems, die Hemmbarkeit durch den spezifischen SERCA-Hemmstoff Thapsigargin sowie die Stimulierbarkeit des Ca2+-Transportes durch Rutheniumrot wurden durch die transgene SERCA2-Überexpression nicht verändert. Unveränderte Phospholambanspiegel und eine verminderte Stimulierbarkeit des kardialen SR Ca2+-Transportes von TG durch Proteinkinase A-abhängige in vitro Phosphorylierung lassen vermuten, dass vom Transgen kodierte SERCA2-Moleküle des SR nicht der Regulation durch Phospholamban unterliegen. In vivo und an isolierten, isovolumetrisch kontrahierenden Herzen konnte gezeigt werden, dass die kardiale SERCA2-Überexpression keine signifikanten Veränderungen der basalen systolischen und diastolischen Funktionsparameter verursachte. Im Gegensatz dazu, waren die positiven inotropen und lusitropen Wirkungen des beta- Agonisten Isoproterenol an isolierten Herzen von TGR deutlich stärker ausgeprägt als an Herzen nicht-transgener Kontrolltiere. Auf Organebene lassen sich somit die kontraktilen Auswirkungen einer verbesserten SERCA2-Ausstattung des kardialen SR transgener Tiere nur bei hoher Belastung des SERCA2-katalysierten Ca2+-Transportsystem nachweisen. Somit sind die in dieser Arbeit charakterisierten SERCA2-transgenen Ratten ein geeignetes Modell, um die potenziell präventive Wirkung einer primär verbesserten SERCA2-Ausstattung des SR bei sekundär induzierter Herzhypertrophie/-insuffizienz zu untersuchen.

Cellular Ca2+ regulation disorders play an essential pathogenic role in diastolic and systolic dysfunction typically occurring in hypertrophy and insufficiency of heart muscle. Decreased SERCA2a mediated sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ transport has been identified as an important factor in myocardial Ca2+ dysregulation. Therefore, suitable interventions have been intensively searched to enhance activity of SR Ca2+ transport. Permanent or inducible SERCA2 overexpression has been developed in transgenic animal models on which a further heart insufficiency can be experimentally generated. However, foundational investigations of these transgenic models require a precise characterization of cardiac phenotype under physiological conditions. In this study we characterized the cardiac phenotype of SERCA2 transgenic rats (TG) carrying a SERCA2 transgene regulated by an hCMV-enhancer/ß-actin- promoter. Genome of heterozygote TG comprised 16 copies of the cardiacally transcripted SERCA2 transgene. SERCA2 overexpression in left ventricular myocardium accounted for +50% and +20% in the mRNA and protein levels respectively. Atrial expression of SERCA2 transgene was also detected. An enhancement of up to 49% in Ca2+ transport activity of SR was identified in left ventricular homogenates of male as well as female rat. Furthermore, SERCA2 overexpression had no effect on the Ca2+ affinity of the reticular Ca2 transport system, on the inhibitory activity of the specific SERCA inhibitor, namely thapsigargin, and on the stimulating activity of Ca2+ transport which is exerted by ruthenium red. Unchanged phospholamban levels and the decreasing stimulating effects of protein kinase A dependent in vitro phosphorylation on cardiac Ca2+ transport of SR in TG could be explained by the assumption that SERCA2 transgene coded Ca2+ pump molecules are not in control of phospholamban. Isovolumetrically contracting Langendorff rat hearts showed that the cardiac SERCA2 overexpression did not cause significant changes in the basal parameters of systolic and diastolic functions. In contrary, positive inotropic and lusitropic effects of beta-agonist isoproterenol were significantly stronger in TG than those in non transgenic rat hearts. The contractive cardiac outcome of TG could be solely detected at organ level under the high burdens of the SERCA2 catalyzed Ca2+ transport system. We concluded that SERCA2 transgenic rats characterized in this study were an appropriate model for further investigation of the potential preventive effect of a primitively improved SERCA2 mediated SR Ca2+ transport system on secondary induced heart hypertrophy as well as insufficiency.