Funktionelle Charakterisierung der HERV-K Proteine Env und Rec

Abstract

Das humane endogene Retrovirus-K113 (HERV-K113) ist eines der jüngsten und am besten erhaltenen endogenen Proviren des Menschen. Es stellt ein potentiell replikationskompetentes Retrovirus dar, dessen Expression zur Entstehung von Tumor- und Autoimmunkrankheiten beitragen könnte. In Anpassung an den Wirt wurden seit der Integration die viralen Proteine durch Mutation in ihrer Expression stark reprimiert. Auch das Hüllprotein wird im Wildtyp kaum exprimiert. Durch den Austausch von acht Aminosäuren konnte das Hüllprotein wieder in einen funktionellen Zustand gebracht werden. Die Expression wurde durch eine Codonoptimierung soweit gesteigert, dass es möglich war, das HERV-K113 Env funktionell zu untersuchen. Das korrigierte Env wird prozessiert, effektiv in Viruspartikel eingebaut und kann Infektionen vermitteln. Durch weitere Optimierungsstrategien, beispielsweise durch Verwendung zusätzlicher Verstärker der Virusinfektion, konnte die Infektiosität weiter gesteigert werden. HERV-K113 steht unter Verdacht, bei der Auslösung einiger Tumorerkrankungen, darunter auch Keimzelltumore, beteiligt zu sein. Eine besondere Rolle spielt dabei das akzessorische Rec- Protein, welches für seine Funktion als Shuttleprotein der viralen RNA mit einer Vielzahl von Wirtsfaktoren interagieren muss. In einem YTH-Screen wurden zwei Interaktionspartner des Rec-Proteins gefunden: Staufen-1 und hSGT. Für beide Proteine wurde die Interaktion in Coimmunpräzipitationen und Coimmunfluoreszenzexperimenten bestätigt. In einem Luziferase-basierenden Reporterassay konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression beider Proteine den Rec-vermittelten nukleozytoplasmatischen RNA-Transports verstärkt. Die Interaktion mit Staufen-1 macht deutlich, dass die Funktionalität von Rec nicht auf den Kerntransport beschränkt ist, und dass Ribonukleoproteinpartikel bei der Replikation eine wichtige Rolle spielen. So ist es dem Virus möglich, sämtliche Viruskomponen- ten an einen spezifischen Ort zu dirigieren. Rec verbleibt zudem nach dem Kerntransport an der viralen RNA, was weitere regulatorische Aktivitäten auf Translations- und Verpackungsebene impliziert. Die Interaktion von Staufen-1 und Rec könnte auch einen antiviralen Kontrollmechanismus der Wirtszelle darstellen. Unter Stressbedingungen akkumulieren Rec und Staufen-1 in der Stressgranula. Zusammen mit anderen antiviralen Wirtsproteinen wie HMM APOBEC3G und TIA-1 könnten auf diese Weise die viralen Volllängentranskripte von der Translations- und Verpackungsmaschinerie isoliert werden. Auch hSGT ist ein wichtiger Interaktionspartner für das HERV-K Rec-Protein. Bindet Rec den Regulator hSGT, wird der Androgenrezeptor stimuliert. Gleichzeitig wird durch den Androgenrezeptor die HERV-K 5’LTR-Aktivität erhöht. Eine daraus resultierende Verstärkung der Rec-Expression kann erneut zu einer erhöhten AR-Aktivtät führen. Auf diese Art und Weise könnte eine stetige, immer schneller voranschreitende Tumorgenese ausgeprägt werden.

Human endogenous retroviruses (HERVs) comprise approximately 8 % of the human genome. All presently recognized elements, including the youngest and most intact proviruses of the HERV-K(HML-2) family, have suffered postinsertional mutations during their time of chromosomal residence, and genes encoding the envelope glycoprotein (Env) have not been spared these mutations. In this study, an authentic Env of the HERV-K113 provirus was reconstituted by back mutation of putative postinsertional amino acid changes and the expression was aided by codon-optimization. The reconstituted Env regained its ability to be incorporated into retroviral particles and to mediate entry. Further optimization of infection, including the use of semen-derived enhancer of infection, yielded in even higher infectivity levels. The Rec protein of the HERV-K is a functional homolog of the Rev protein of HIV. Rec binds selectively to viral RNAs in the nucleus and enhances their transport into the cytoplasm. It can be assumed that Rec has to interact with several host proteins to fulfill its function as a shuttle protein. Applying the YTH- technique two new Rec-interacting proteins were identified: Staufen-1 and hSGT. For both proteins the interaction with Rec is supported by co- immunopreciptitations and subcellular localization studies. The interacting region has been determined by pull down assays and a signi-ficant enhancement of viral mRNA transport by overexpression of Staufen-1 or hSGT can be demonstrated in a luciferase-based reporter assay. Like Rec, Staufen-1 promotes the transport of selected mRNAs by formation of ribonucleoparticles (RNPs). Thus, interaction of these molecules might be crucial to perform viral RNA shuttling via RNPs. Furthermore, Rec remains at the viral RNA after the nucleocytoplasmic transport. This implicates additional regulatory functions of the shuttle protein. Besides its RNA transport function Staufen-1 is also associated with stress granules. These granules silence RNA transcription during stress situations within the cell. Interestingly, the high molecular mass (HMM) form of APOBEC3G, a cellular protein which restricts viral replication and retrotransposition, has been found in Rec/Staufen-1 granules. Consequentially, interaction between Rec and Staufen-1 might be part of a defense mechanism preventing intracellular proliferation of HERV-K elements. HSGT plays an important role during mitosis and in regulation of the androgen receptor (AR). An interaction of hSGT with Rec yielded in an higher susceptibility of the AR to its ligands and to an increased transcription activity mediated by the free AR. As a side effect, viral LTR activities were enhanced which may also result in the observed increase of viral particles in the supernatant. These findings contribute to the understanding of the Rec protein as a nucleocytoplasmic shuttle protein and, with respect to hSGT, may indicate a mechanistic implication in cancer development.