Vergleichende Transkriptomanalyse der Ko-Kulturen einer bovinen permanenten Zelllinie sowie boviner CD14+ -Zellen mit Mycoplasma mycoides subspecies mycoides bzw. Mycoplasma mycoides subspecies capri

Abstract

Die Lungenseuche des Rindes, verursacht durch Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm), ist eine bedeutende Respirationskrankheit der Rinderartigen. Ziel dieser Studie war es, erste Mechanismen des Immunsystems der bovinen Wirtszelle nach Kontakt mit Mmm darzulegen, um gezielte weiterführende Untersuchungen zu ermöglichen. Hierzu wurden sowohl eine permanente bovine Lungenepithelzelllinie (EBL) als auch über magnetische Zellseparation aufgereinigte bovine CD14+ -Zellen mit Mmm und seinem nächsten Verwandten Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), ein Pathogen kleiner Wiederkäuer, ko-kultiviert. Die Dauer der Ko-Kultur betrug für die mit den EBL-Zellen durchgeführten Experimente 4 h und 24 h. Die CD14+ -Zellen wurden für 24 h mit Mmm bzw. Mmc ko-kultiviert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Ko-Kultur mit dem jeweiligen Mykoplasmenstamm auf die Zellvitalität bestimmt und eine Duplex qPCR etabliert, um die Erreger-Wirtszell-Ratio zu bestimmen. Anschließend wurden die durch die Ko-Kulturen induzierten Transkriptomveränderungen ausgewertet. Sowohl die Mykoplasmen des verwendeten Mmm-Stamms, Afadé, als auch die Mykoplasmen des verwendeten Mmc-Stamms, Y-Goat, adhärierten an den bovinen Zellen. Unabhängig von der Wirtspezifität der Mykoplasmen wurde eine hohe Anzahl ähnlich regulierter Transkripte nach Kontakt der EBL-Zellen sowie der CD14+ -Zellen mit Mmm bzw. Mmc nachgewiesen. Es wurde eine proinflammatorische Antwort initiiert und auch das angeborene Immunsystem aktiviert. Die hervorgerufenen Transkriptomveränderungen waren in beiden verwendeten bovinen Zelltypen in der Ko-Kultur mit Mmm deutlich stärker ausgeprägt als in der Ko-Kultur mit Mmc. Die mit Mmc ko-kultivierten Zellen zeigten keinen Zellvitalitätsverlust. In der Ko-Kultur mit Mmm verringerte sich die Zellvitalität sowohl der EBL-Zellen als auch der CD14+ -Zellen um etwa 30 %. Durch die Analyse der Transkriptregulation, welche beide Stämme auslösten, wurden Gemeinsamkeiten in der durch die Ko-Kultur induzierte Wirtsantwort gezeigt. Beide Mykoplasmen schienen einen intensiven Kontakt zur bovinen Lungenepithelzelle aufgebaut zu haben. Es wurden Transkripte, welche in die Cholesterol-Biosynthese involviert sind, sowie Transkripte für verschiedene Membrantransporter hochreguliert. Es ist zu vermuten, dass beide Mykoplasmenstämme Nährstoffe aus der bovinen Zelle bezogen. Die gemeinsame Antwort war durch eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems und der Aktivierung sowie Rekrutierung Neutrophiler gekennzeichnet. Es kam zu oxidativem Stress, welchem sinnvoll entgegen reguliert wurde. Um die Zellintegrität zu erhalten, wurden DNA-Reparatur- und Apoptose-Mechanismen eingeleitet. Es wurden Transkripte reguliert, welche eine antiinflammatorische Immunantwort initiieren könnten. In der Ko-Kultur der EBL-Zellen mit Mmc wurden Transkripte reguliert, welche zunächst zu einem Zellzyklusarrest führen könnten. Es erfolgte ein kontrollierter Umgang mit Zellschäden. Durch die Herunterregulation verschiedener Tumorsuppressor-Transkripte und Verstärkung der negativen Regulation des programmierten Zelltods wurde das Zellwachstum gefördert und die Integrität der Epithelzellschicht blieb erhalten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die EBL-Zellen adäquat auf die Ko-Kultur mit Mmc reagierten und es in der Folge nicht zu einem Zellvitalitätsverlust kam. Bei der Ko-Kultur mit Mmm hingegen konnte keine gezielte Orchestrierung der Immunantwort beobachtet werden. Bereits nach 4 h war neben einem ausgeprägten DNA-Schadensstimulus und dem damit verbundenem Zellzyklusarrest und der Apoptose eine starke proinflammatorische Antwort zu erkennen. Diese blieb auch nach 24 h Ko-Kultur bestehen. Neben der deutlichen Aktivierung und Rekrutierung Neutrophiler wurden Transkripte für die Aktivierung weiterer Effektorzellen reguliert. Es schien zu einer überschießenden Immunantwort zu kommen. Diese war sowohl in eine Th1- als auch in eine Th17-Antwort involviert. Sowohl die Ko-Kultur mit dem ziegenpathogenen Mykoplasmenstamm Mmc als auch die Ko- Kultur mit dem rinderpathogenen Mykoplasmenstamm Mmm führten zu einer ausgeprägten Immunantwort der bovinen Monozyten. Die mykoplasmenspezifische Antwort der CD14+ - Zellen zeigte sowohl proinflammatorische und bakterizide Aspekte als auch eine sinnvolle antiinflammatorische Seite mit Schutz vor Dysregulation des Immunsystems und unkontrollierter Entzündung. Ein Teil der herunterregulierten Transkripte könnte ein mykoplasmen-induzierter Schutzmechanismus zum Umgehen der Immunantwort des Wirtes sein. Es wurden verschiedene Transkripte, welche für Gene, die die Aktivierung und die Anlockung von Neutrophilen codieren, herunterreguliert. Auch die mRNA-Mengen von anti- viral und anti-bakteriell wirksamen Transkripten waren sowohl in mit Mmm als auch in mit Mmc ko-kultivierten CD14+ -Zellen herunterreguliert. Die Mmc-spezifische Antwort der CD14+ -Zellen war sehr gering und die Veränderungen in der Transkriptregulation waren von geringer Intensität. Mmc schien keine weitere Bedrohung darzustellen, die eine besondere Abwehr benötigte. Im Fokus der Transkriptregulation lag die Aufrechterhaltung des Zellzyklus. Hingegen war die Antwort der CD14+ -Zellen auf die Ko-Kultur mit Mmm die bei allen Experimenten am stärksten ausgeprägte Reaktion. Dies betraf sowohl die Anzahl der regulierten Transkripte als auch deren Regulationsintensität sowie die Anzahl der detektierten angereicherten biologischen Prozesse. Die Mmm-spezifische Antwort war von einer großen Anzahl proinflammatorischer Zytokine geprägt. Die Aktivierung, das Wachstum sowie die Migration von Neutrophilen waren hierbei wichtige Facetten. Ein Teil der regulierten Transkripte interagierte auch mit T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen. Der Großteil der proinflammatorischen Zytokine wies auf eine überschießende Immunantwort hin. Dieser standen einzelne antiinflammatorische Transkripte gegenüber. Die Ko-Kultur mit Mmm führte zu ausgeprägten Zellschädigungen mit Stress des endoplasmatischen Retikulums sowie pro- und anti-apoptotischer Zellzyklus-Regulation. In der Ko-Kultur der CD14+ -Zellen mit Mmm waren verschiedene biologische Prozesse angereichert, welche die Antwort auf ungefaltete Proteine (UPR) betreffen. In den Ko-Kulturen der bovinen Epithelzelllinie waren hingegen sowohl in mit Mmm als auch in mit Mmc ko-kultivierten EBL-Zellen biologische Prozesse, welche in die UPR involviert waren, angereichert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl Lungenepithelzellen als auch bovine Monozyten in zukünftige immunpathologische Betrachtungen zur Lungenseuche der Rinder einbezogen werden sollten.