Untersuchung der frühen Knochen- Band- Einheilung von allogenen Bandtransplantaten als Ersatz des vorderen Kreuzbandes nach Sterilisation mit dem Peressigsäure- Ethanol- Unterdruck- Verfahren: eine tierexperimentelle Studie am Schafsmodell

Abstract

Die Sterilisation von Allografts für die Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes (VKB) ist eine Grundvoraussetzung, um eine Übertragung von Infektionskrankheiten zu verhindern. Jedoch existieren zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Sterilisationsmethoden, die einerseits eine diesbezüglich ausreichende Sicherheit bieten, ohne andererseits die biologischen und biomechanischen Eigenschaften der behandelten Transplantate zu beeinträchtigen. Das Peressigsäure- Ethanol- Unterdruck- Verfahren (PES) hat sich bei der Sterilisation von Knochengewebe im klinischen Alltag bewährt und hat auch bei der Verwendung für Sehnengewebe in einem in vitro- Versuch keine negative Beeinflussung der biologischen und biomechanischen Eigenschaften gezeigt. Nach unserem Kenntnisstand ist dies die erste Studie, die die Knochen- Band- Einheilung während der frühen Heilungsphase von allogenen Bandtransplantaten als Ersatz des vorderen Kreuzbandes nach Sterilisation mit dem Peressigsäure- Ethanol- Unterdruck- Verfahren in einem in-vivo Modell untersucht hat. Bei insgesamt 18 Schafen wurde eine Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes mit einer PES- sterilisierten, allogenen Weichteiltransplantat (Flexorensehne) vorgenommen und dabei das Transplantat extraartikulär fixiert. Als Standzeiten wurden sechs und zwölf Wochen gewählt. Neben den histologischen Untersuchungen der Knochen- Band- Einheilung wurden auch biomechanische Testungen durchgeführt sowie das Transplantatremodeling und die Revaskularisierung untersucht. Die Ergebnisse wurden in Bezug mit einer vorangegangen Studie gesetzt, die eben diese Aspekte bei Autografts und fresh- frozen Allografts betrachtet haben. Verglichen mit den fresh- frozen Allografts aus der Vorgängerstudie wiesen die PES- Allografts nach 6 und 12 Wochen eine weiter fortgeschrittene Knochen- Band- Heilung auf, vergleichbar mit den histologischen Ergebnissen der Autografts. Zum späteren Zeitpunkt war diese Entwicklung auf der tibialen Seite ausgeprägter als auf der femoralen. Dies lässt eigentlich vermuten, dass die verbesserte Bandinsertion auch verbesserte mechanische Eigenschaften der gesamten VKB- Rekonstruktion beinhaltet. In unseren biomechanischen Testungen wiesen die PES- Allografts jedoch signifikant schlechtere strukturelle Eigenschaften auf. Diese Beobachtungen verdeutlichen die Wichtigkeit der Untersuchungen der Knochen- Band- Einheilung einerseits sowie des intraartikulären Transplantatremodelings andererseits, wobei sich dieser Prozess bei den PES- behandelten Allografts im Vergleich zu den nicht- sterilisierten signifikant verzögert zeigte. Daher kann aktuell die Verwendung des Peressigsäure- Ethanol- Unterdruck- Verfahrens zur Sterilisation des gesamten Weichteiltransplantates als Ersatz des vorderen Kreuzbandes nicht empfohlen werden.

Allogenic tissue has become an important graft option for the reconstruction of the anterior cruciate ligament. Recent reports of disease transmission following ACL reconstruction with fresh-frozen non-sterilized allografts have highlighted the need for new sterilization techniques that do not impair the mechanical or biological properties as it was shown for most of the current sterilization techniques. Peracetic acid (PAA) has been successfully used to sterilize bone allografts without these disadvantages and does not impair the mechanical properties of soft tissue grafts in vitro 1. This study aimed to examine invivo the impact of PAA sterilization of soft-tissue grafts on the tendonbone incorporation in ACL reconstruction. We hypothesized that PAA sterilization would not interfere with tendon bone healing as compared to non- sterilized allografts during short-term healing in a sheep model. METHODS: 18 mature female merino sheep underwent open intraarticular ACL reconstruction using peracetic acid ethanol sterilized flexor tendon allografts. Following the surgical procedure immediate weight bearing was tolerated and normal gait was confirmed. Animals were followed for 6 and 12 weeks. Proximal tibia and distal femora were harvested and cut sagittally in the center of the expected tendon bone interface using a precision saw system. Cuts were embedded into PMMA for undecalcified histologies and 6μm serial sections were created with a hard tissue microtome. Masson Goldner Trichrome (MG), a modified Safranin O-van Kossa (SOK) stain and Alcian blue (AB) techniques were used for visualization of the different tissue structures. Descriptive analysis of the specimens was carried out using normal light microscopy. Type and maturity of the tendon bone insertion was evaluated using the scoring system below. Results were compared with the results from our previous study, where we compared the tendon bone healing from fresh frozen allograft versus autograft in the same animal model using same time period and evaluating score. Scoring system for tendon- bone incorporation (TBI): Stage :Description: 0:No signs of direct tendon insertion (TBI); I:TBI with uncalcified chondroid cell formation; II:TBI with calcified chondroid cell formation; III: Immature direct TBI; IV:Mature direct TBI. RESULTS: No surgical complications occurred in18 sheep. Full weight bearing was observed at an average of 14 days. After six weeks femoral and tibial specimens had similar findings in the PAA group Two of the samples showed no signs of a direct tendon bone insertion (stage 0). Two samples showed uncalcified chondroid cell formations located especially at the posterior bone tunnel aperture side (stage I). 4 Samples showed advanced tendon bone healing with a high number of chondroid cells in the tendon bone interface mainly located at the posterior bone tunnel aperture (stage II) One sample already showed an advanced immature direct TBI with multiple coloums of chondroid cells and wide zones of mineralization. Sharpey like fibers were found along the tendon-bone interface with an accumulation at the bottom of the bone tunnel Non-sterilized allografts showed a significantly lesser degree of maturation at 6 weeks of healing. At 12 weeks, the femoral specimens showed only few signs of progressive tendon bone healing. In the two specimens with stage II maturity, this healing was only observed at anterior site of the bone tunnel entrance. TBI stage III was found in one specimen with many chondroid like cells and a wide mineralization zone. The tibial specimens showed a more progressed maturity of the tendon-bone interface with 4 samples graded stage II and III. One specimen already resembled the typical distinct four transition zones of ligament, fibrocartilage, mineralized cartilage and bone. The expression of Sharpey like fibers increased along the graft bone interface in the femoral and tibial tunnel compared to 6 weeks of healing. Non-sterilized allografts did not show substantial differences in femoral tendon-bone healing at 12 weeks anymore. However, on the tibial side maturity of the tendon-bone interface was still reduced compared to PAA grafts. DISCUSSION: To our knowledge this study is one of the first reports analyzing the tendon bone healing of peracetic acid treated free soft tendon allografts in an in-vivo model of ACL reconstruction. Compared with the results from fresh frozen allografts from our previous study, the tendon bone healing of PAA treated tendons progressed earlier at 6 and 12 weeks. With advancing time, these differences were more pronounced on the tibial than on the femoral tendon-bone interface. It could be assumed that the improved tendon-bone healing of PAA grafts would provide advantageous mechanical properties. However, during mechanical testing we discovered significantly lower structural properties 2 in the PAA group. This observation underlines the importance of analyzing the biological healing of the tendon-bone interface and the intraarticular graft remodeling, which we found to be significantly delayed in PAA treated compared to non-sterilized allografts. Therefore, we cannot currently recommend PAA sterilization in ACL reconstruction.