Effektivität intrakutan verabreichter Gelatinenanopartikel-gebundener CpG-ODN als lokales Therapeutikum bei Pferden mit Sommerekzem: Untersuchungen zu klinischen und antiinflammatorischen Effekten

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, im in vivo-Teil den immunmodulatorischen Effekt nanopartikulärgebundener CpG-ODN an zehn an Sommerekzem erkrankten Pferden zu untersuchen. Dazu wurden die Tiere im Zeitraum Juni bis Dezember 2020 zweimal innerhalb von fünf Wochen in einem Abstand von jeweils zwei Tagen mit CpG-GNP behandelt. Die intrakutane Applikation erfolgte an den beiden Prädilektionsstellen Mähnenkamm und Schweifrübe. Im in vitro-Teil wurde untersucht, ob sich durch die Behandlung mit CpG-GNP immunmodulatorische Effekte nachweisen ließen. Bei jedem der fünf Untersuchungszeitpunkte wurden die Pferde und Ponys allgemein untersucht. Der allgemeinen Untersuchung schloss sich die dermatologische Untersuchung mit der Ermittlung der Ekzemerscores an. Weiterhin wurden den Pferden Serumproben entnommen, um aus ihnen IgE-Antikörper-Titer und die Sekretion des Zytokins IL-4 zu bestimmen. Zusätzlich wurde EDTA-Blut gewonnen, um die daraus isolierten PBMC in drei Ansätzen mit CpG-GNP, CpG-ODN und GNP zu inkubieren und anhand ihrer Proliferationsraten und Zytokinprofile (eIL-4, eIL-10, eIFN-ỿ) die immunstimulatorische Wirkung zu untersuchen. Des Weiteren wurde bei den Tieren der Sommerekzemgruppe bei der Erst- und Abschlussuntersuchung ein Intradermaltest mit fünf Allergenen durchgeführt. Mit dem in der vorliegenden Studie angewandten Behandlungsschema der CpG-GNP konnte über den gesamten Studienverlauf ein signifikant positiver Effekt auf die klinischen Symptome des Sommerekzems der behandelten Pferde und Ponys nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Untersuchungsterminen in den Heimatställen wurden die Symptome und Ekzemerscores durch die Besitzer ermittelt. In weiterführenden Studien sollte eine zeitgleiche Einbestellung aller Probanden stattfinden, um unter gleichen Witterungsbedingungen eine optimale Vergleichbarkeit der symptomatischen Besserungen zu gewährleisten. Um die Wetterverhältnisse und die Vergleichbarkeit der SE-Symptome auch während der Betreuung in den Heimatställen sicherzustellen, sollten sich die Ställe aus logistischen Gründen in einer Region befinden. Weiterhin sollte die Expression von IL-4 vergleichend sowohl in Serumproben als auch in Hautbiopsien aus Läsionen bestimmt werden. Dabei wäre zu überprüfen, ob die Messung in Hautbiopsien betroffener Pferde die aussagekräftigere diagnostische Methode für das Krankheitsbild des Sommerekzems darstellt. Weiterhin ist auch die Bestimmung zusätzlicher bzw. anderer Zytokine zu bedenken, um die Modulation der Immunreaktionen von SE-Patienten zu überprüfen und zuverlässig nachzuweisen. Im in vitro-Teil der Studie konnte für die Zellproliferation und für die Expression der bestimmten Zytokine aufgrund der unerwarteten Beobachtungen und unplausiblen Ergebnisse keine sichere Aussage zur immunmodulatorischen Wirkung der CpG-GNP gemacht werden. So stiegen die Konzentrationen von eIL-4, eIL-10 und eIFN-γ nach der Behandlung der Sommerekzempatienten statistisch signifikant an- abhängig von der jeweiligen Konzentration der CpG-GNP, der CpG-ODN und der GNP. Auch die PBMC wiesen nach Inkubation konzentrationsabhängig sowohl durch CpG-ODN, CpG-GNP als auch durch GNP eine Stimulation auf. Gelatinenanopartikel werden als immunologisch inertes Transportsystem verwendet. Ein immunmodulatorischer Einfluss von GNP wurde bisher nicht beschrieben. Anhand der Beobachtungen und Ergebnisse wurden zwei Annahmen in Hinsicht auf die Ursachen getroffen. Die erste Annahme beinhaltete eine fehlende Sterilität als Ursache für den immunmodulatorischen Einfluss der GNP, während die zweite Annahme die Ursache in den Eigenschaften der verwendeten A-Gelatine vermutete. Weiterführende Studien sind sinnvoll, um diese Annahmen und den potenziell immunmodulatorische Einfluss von Gelatine bzw. Gelatinenanopartikel unter Verwendung verschiedener Gelatine-Typen zu untersuchen.

The aim of this study was to investigate the immunomodulatory effect of nanoparticle-bound CpG-ODN on ten horses suffering from sweet itch in the in vivo part. To this end, the animalswere treated with CpG-GNP twice within five weeks at intervals of two days between June and December 2020. The intracutaneous application was carried out at the two predilection sites of the mane ridge and tail rump. The in vitro part of the study investigated whether immunomodulatory effects could be detected as a result of treatment with CpG-GNP. The horses and ponies were generally examined at each of the five time points. The General examination was followed by a dermatological examination to determine the eczema scores. Furthermore, serum samples were taken from the horses to determine IgE antibody titres and the secretion of the cytokine IL-4. In addition, EDTA blood was obtained in order to incubate the PBMC isolated from these samples in three approaches with CpG-GNP, CpG-ODN and GNP and to investigate the immunostimulatory effect based on their proliferation rates and cytokine profiles (eIL-4, eIL-10, eIFN-ỿ). Furthermore, an intradermal test with five allergens was carried out on the animals in the sweet itch group at the initial and final examinations. The CpG-GNP treatment regimen used in this study demonstrated a significant positive effect on the clinical symptoms of sweet itch in the treated horses and ponies over the entire course of the study. The symptoms and eczema scores were determined by the owners between the individual examination appointments at the home stables. In further studies, all test subjects were to be called in at the same time in order to ensure optimum comparability of symptomatic improvements under the same weather conditions. For logistical reasons, the stables should be located in the same region to ensure the weather conditions and the comparability of the SE symptoms during the care in the home stables. Furthermore, the expression of IL-4 should be determined comparatively both in serum samples and in skin biopsies from lesions. It should be checked whether the measurement in skin biopsies of affected horses is the more meaningful diagnostic method for the clinical picture of sweet itch. Furthermore, the determination of additional or other cytokines should also be considered in order to verify and reliably prove the modulation of the immune reactions of SE patients. In the in vitro part of the study, no reliable statement on the immunomodulatory effect of CpG-GNP could be made for cell proliferation and for the expression of the specific cytokines due to the unexpected observations and implausible results. For example, the concentrations of eIL-4, eIL-10 and eIFN-γ increased statistically significantly after treatment of the summer eczema patients, depending on the respective concentration of CpG-GNP, CpG-ODN and GNP. The PBMC also showed a concentration-dependent stimulation by CpG-ODN, CpGGNP and GNP after incubation. Gelatine nanoparticles are used as an immunologically inert transport system. An immunomodulatory influence of GNP has not yet been described. Based on the observations and results, two assumptions were made with regard to the causes. The first assumption included a lack of sterility as the cause of the immunomodulatory influence of GNP, while the second assumption assumed the cause to be the properties of the A-gelatine used. Further studies would be useful to investigate these assumptions and the potential immunomodulatory influence of gelatine or gelatine nanoparticles using different types of gelatine.