Entwicklung eines verfahrens zur Herstellung eines rein autologen Fibrinklebers und dessen Anwendung im Tissue Engineering von Knorpelgewebe für die plastisch-rekonstruktive Chirurgie

Abstract

Durch die Methoden des Tissue Engineerings wird versucht Zellen mit geeigneten Biomaterialen als Matrix zu verbinden um daraus Ersatzgewebe zu züchten. Wegen vieler für eine Matrix günstiger Eigenschaften und insbesondere wegen seiner hervorragenden Biokompatibilität ist Fibrin zu einer häufig verwendeten Matrix im Tissue Engineering geworden. Autologes Fibrinogen wurde bisher mit bovinem Thrombin zur Polymerisation gebracht, welches bei wiederholter Anwendung jedoch gelegentlich zu zum Teil schwersten immunologischen Nebenwirkungen und in einigen Fällen sogar zum Tode führte. Ziel dieser Untersuchung war es ein Verfahren zu entwickeln alle nötigen Komponenten autolog aus dem Plasma eines einzigen Patienten zu gewinnen. Nach Fällung von Fibrinogen mittels Cryopräzipitation wurde Thrombin durch Ionenaustauschchromatographie aus etwa 200ml Plasma herausadsorbiert. Hierbei wurde Thrombin zunächst an Sephadex A-50 gebunden, dann mittels eines Salz Puffers eluiert und letztlich durch Sephadex G-50 von Salz gereinigt. Im Hinblick auf eine klinische Anwendbarkeit wurde hierfür der Prototyp eines Einmalsets entworfen, welcher die gesamte Präparation innerhalb eines geschlossenen Systems erlauben sollte. Die mit diesem Prototypen hergestellten Thrombinkonzentrate ergaben Werte mit einer sehr hohen Schwankungsbreite von 0,4 600 NIH, einem Mittelwert von 129,39 NIH und einer Standardabweichung von 244,47 NIH. Wegen der schlechten Reproduzierbarkeit der Thrombinaktivitäten wurde deshalb in einem weiteren Ansatz eine Präparationseinheit entwickelt, die eine bessere Kontrollierbarkeit der einzelnen Arbeitsschritte erlaubte. Die hiermit hergestellten Thrombinkonzentrate zeigten eine größere Homogenität der Thrombinaktivität mit Werten von 51,9 414 NIH, einem Mittelwert von 186,2 NIH und einer Standartabweichung von +/- 81,1 NIH/ml. Durch das hier vorgestellte Verfahren konnte so erstmals ein Fibrinkleber aus rein autologen Komponenten hergestellt werden, welcher es ermöglichte sowohl immunologische Reaktionen als auch die Übertragung von Virusinfektionen sicher auszuschließen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Fibrinmatrix zur Rekonstruktion eines Ohrmuscheldefektes eingesetzt. Dem Patienten wurde hierfür Rippenknorpel entnommen, dessen Zellen in-vitro kultiviert und durch den Fibrinkleber und eine nach epithetischen Verfahren hergestellte Gussform in eine präzise und defektanaloge Form gebracht wurden. Nach einer weiteren in-vitro Reifungsphase erfolgte die operative Einpassung des Transplantates. Obwohl der Defekt mit dem Transplantat gut zu rekonstruieren war ließ die plastische Stabilität mit zunehmender postoperativer Dauer nach, so dass zu einem späteren Zeitpunkt die Ohrmuschel mit Conchaknorpel der Gegenseite verstärkt wurde. Die Erhaltung einer präzisen und bestimmten Form bleibt daher weiterhin die größte Herausforderung im Tissue Engineering von Knorpelgewebe für die plastisch-rekonstruktive Chirurgie. Insbesondere auf die in-vivo Integration von gezüchteten Transplantaten und den Schutz vor Reaktionen des umgebenden Gewebes sollte in Zukunft noch näher eingegangen werden.

Methods of tissue engineering combine cells and biomaterials to grow regenerative tissue. Because of its excellent biocompatibility fibrin has become a frequently used matrix in tissue engineering. To date, autologous fibrinogen has usually been polymerised with bovine thrombin. Bovine thrombin, however can cause severe immunological side effects and in some cases patients even died after recurrent use. The objective of this study was to explore the practicability of obtaining autologous thrombin from a single patient in an adequate concentration and amount. After fibrinogen was cryoprecipitated from about 200 ml of freshly-frozen plasma, thrombin was isolated from the supernatant through ion-exchange chromatography. The thrombin was first bound to Sephadex A-50, then eluated using a salt buffer and finally purified from the salt through Sephadex G-50. To provide a system for clinical application a prototype of a single use unit which allowed preparation in a closed system was developed. With this prototype we reached a high variety of thrombin concentration from 0,4 600 NIH with a mean of 129,39 NIH and a standard deviation of +/- 244,47 NIH. Because of the poor reproducibility of the thrombin activity, the production unit was modified into an open system to get a better control of every single preparation step. The thrombin concentration with this open system reached a higher homogeneity of thrombin with activities between 51,9 414 NIH a mean of 186,2 and a standard deviation of +/- 81,1 NIH. The study has shown that it is possible to obtain a sufficient amount of autologous thrombin from a single donor to create a fibrin matrix of high efficiency without the risk of immunological and infectious side effects. In a first clinical application the fibrin matrix has been used to reconstruct a defect of an auricle. Chondrocytes were amplified after taking a small sample of costal cartilage and autogenous blood plasma was processed to fibrinogen, thrombin and serum. A form for building an exactly suiting transplant was made using epithetic techniques. It has been demonstrated that it is possible to engineer a precisely formed cartilage graft made of pure autogenous components. Though the transplant fitted exactly into the existent defect at time of transplantation the long term result was rather moderate. After resorption processes the cartilage lost plastic stability and had to be supported with ear cartilage from the left side. The maintenance of a precise anatomic architecture remains the most significant hurdle to overcome. In particular the in vivo integration and the protection of the engineered transplants after implantation needs more attention, before this technology is clinically more feasible in plastic and reconstructive surgery.