Human herpesvirus 6: excision of integrated viral genomes from host telomeres and impact of telomere length on viral integration

Abstract

Human herpesviruses 6A and 6B are two closely related betaherpesviruses with the ability to integrate their genomes into the host chromosomes, establish a latent infection and persist in the host for life. These viruses can also infect germ cells and be inherited by the offspring, resulting in individuals who harbor the integrated virus in every cell of their body. This condition is termed inherited chromosomally integrated HHV-6A/B (iciHHV-6A/B). However, Integration must not be seen as a dead end for the virus, as it can be released from the chromosome and start a new lytic infection, resulting in different clinical manifestations. The currently available pharmacological treatments can only partially reduce the viral replication and counteract the clinical symptoms. Unfortunately, until now we have neither a way to prevent the viral reactivation nor get rid of the integrated virus. Here we provide the first proof-of-concept that integrated HHV-6A genomes can be successfully removed in vitro from the host chromosomes using CRISPR/Cas9 system and specific guide RNAs targeting the direct repeats of the viral genome. The successful genome removal was achieved in latently infected cells generated in vitro, as well as in iciHHV-6A patient cells, and confirmed using three different techniques: flow cytometry, quantitative PCR (qPCR), and fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses. Our results open the road to possible future clinical applications and provide an additional research tool to further investigate different aspects of HHV-6A biology in vitro. As for many other aspects of HHV-6A/B, the integration process still needs to be fully understood and many questions remain unanswered. HHV-6A/B does not randomly integrate into the host chromosomes, but specifically into the telomeres. We know that the viral telomeric repeats play an essential role, and this aspect raises the question whether the host telomeres length also plays a role in this process. With this question in mind, we developed a method to measure the telomere length by quantitative fluorescence in situ hybridization, confocal microscopy, and computational processing. Our findings suggest that the integration can occur regardless of the telomere length and the integration process itself seems not to have a Major short-term effect on the telomere length. The data generated in the two works presented in this thesis, collectively represent a further step towards a better understanding of HHV-6A/B biology.

Die humanen Herpesviren 6A und 6B sind zwei eng verwandte Betaherpesviren, die die Fähigkeit besitzen, ihre Genome in die Wirtszellchromosomen zu integrieren, eine latente Infektion zu etablieren und lebenslang im Wirt zu überdauern. Diese Viren können auch Keimzellen infizieren und auf die Nachkommen übertragen werden, was dazu führt, dass Individuen das integrierte Virus in jeder Zelle ihres Körpers tragen. Dieser Zustand wird als „erblich chromosomal integriertes HHV-6A/B (iciHHV-6A/B) bezeichnet. Integration darf jedoch nicht als Sackgasse für das Virus angesehen werden, da es aus dem Chromosom freigesetzt werden kann und eine neue lytische Infektion beginnen kann, was zu unterschiedlichen klinischen Manifestationen führt. Die derzeit verfügbaren pharmakologischen Behandlungen können nur teilweise die virale Replikation reduzieren und die klinischen Symptome bekämpfen. Leider haben wir bisher weder einen Weg gefunden, die virale Reaktivierung zu verhindern, noch das integrierte Virus loszuwerden. Hier bieten wir den ersten Nachweis dafür, dass integrierte HHV-6A-Genome in vitro aus den Wirtschromosomen erfolgreich entfernt werden können, indem wir das CRISPR/Cas9-System und spezifische Guide-RNAs, die auf die direkten Wiederholungen des viralen Genoms abzielen, verwenden. Die erfolgreiche Entfernung des Genoms wurde in vitro in latent infizierten Zellen und in iciHHV-6A-Patientenzellen erreicht und mit drei verschiedenen Techniken bestätigt: Durchflusszytometrie, quantitative PCR (qPCR) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Unsere Ergebnisse eröffnen mögliche zukünftige klinische Anwendungen und bieten ein zusätzliches Forschungsinstrument, um verschiedene Aspekte der HHV-6A Biologie in vitro weiter zu untersuchen. Wie bei vielen anderen Aspekten von HHV-6A/B muss der Integrationsprozess noch vollständig verstanden werden, und viele Fragen bleiben unbeantwortet. HHV-6A/B integriert sich nicht zufällig in die Wirtschromosomen, sondern spezifisch in die Telomere. Wir wissen, dass die viralen Telomere eine wesentliche Rolle spielen, und dies wirft die Frage auf, ob auch die Telomere der Wirtszellen eine Rolle in diesem Prozess spielen. Um diese Frage zu beantworten haben wir eine Methode zur Messung der Telomerlänge entwickelt, die quantitative Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, konfokale Mikroskopie und computergestützte Verarbeitung umfasst. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Integration unabhängig von der Telomerlänge erfolgen kann und dass der Integrationsprozess selbst keine wesentlichen kurzfristigen Auswirkungen auf die Telomerlänge zu haben scheint. Die Daten aus den beiden in dieser Thesis vorgestellten Arbeiten stellen gemeinsam einen weiteren Schritt hin zu einem besseren Verständnis der HHV-6A/B-Biologie dar.