The role of three distinct domains of Syntaxin-1, the N-peptide, the SNARE domain and the juxtamembrane domains, during synaptic vesicle release in Syntaxin-null mouse hippocampal autaptic neurons

Abstract

Chemical synapses are the points of contact through which information flows between neurons. The fusion of neurotransmitter-filled vesicles with the plasma membrane is at the center of this cellular process. This fusion is orchestrated by three soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) proteins, among which Syntaxin-1 (STX1) is paramount. Anchored to the plasma membrane through a transmembrane domain (TMD), STX1 interacts with the other two SNARE proteins (Synaptobrevin-2 and SNAP-25) through its SNARE domain to form the SNARE complex. Regulatory proteins including Synaptotagmin-1, complexin and Munc18-1, also interact with STX1 through the SNARE domain. Additionally, STX1 has many other regulatory domains such as the N-peptide, the Habc-domain, the linker region, and the juxtamembrane domain (JMD). Understanding the individual roles of these domains can help us unravel the complex process that is vesicle fusion. In this compilation of studies, we make use of a mouse hippocampal neuronal model lacking STX1 (STX1-null). In these STX1-null neurons we can express genetically modified constructs of STX1 which target different domains and perform structure-function analysis by studying the electrophysiological responses of these neurons. Our goal is to elucidate the specific roles of distinct STX1 domains. First, we characterized the role of the N-peptide of STX1, which has been reported to be indispensable for the function of STX1 in vesicular release, in the natural and constitutively open conformations of STX1, which has been reported to be indispensable for the function of STX1 in vesicular release. For this we created increasing deletions of the N-peptide up until the Habc-domain of STX1 and expressed these mutant constructs in our STX1-null neuron model. Our results concluded that the N-peptide is non-essential for neurotransmitter release, however it has a regulatory role in the Ca2+-triggered release. Second, we performed an in-depth analysis of the role of the juxtamembrane domain (JMD) and the transmembrane domain (TMD) of STX1, and the role of palmitoylation of these two domains in vesicular release. In order to do this first we created STX1 constructs which carry elongations at either side of the JMD, to understand the precise function of the continuity between SNARE domain and JMD and JMD and TMD. Our results showed that the structural continuity between SNARE domain and JMD and JMD and TMD is essential for spontaneous and Ca2+-evoked vesicular release. Additionally, mutating residues that are targets of palmitoylation of these domains showed that the palmitoylation of the TMD (which is regulated by the JMD) is an important regulatory mechanism in spontaneous release. Finally, we studied the function of the SNARE domain of STX1. For this we performed a chimeric approach using STX1 and an isoform, STX2. This analysis consisted on interchanging the Nterminal half, the C-terminal half or the entire SNARE domain between the two isoforms. Our results showed that the C-terminal half of the SNARE complex of STX1 has a regulatory function on the stability of the primed vesicles and in the spontaneous release of vesicles. Furthermore, we created point mutations in the C-terminal half of the SNARE domain of residues that differed between STX2 and STX1 and found that residues D231 and R232 seemed to be especially important for these two functions. This comprehensive study contributes to our understanding of the nuanced mechanisms governing synaptic vesicle fusion.

Chemische Synapsen sind die Kontaktpunkte, durch die Informationen zwischen Neuronen fließen. Die Fusion von neurotransmittergefüllten Vesikeln mit der Plasmamembran steht im Mittelpunkt dieses zellulären Prozesses. Diese Fusion wird von drei löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiven Faktor-Anlagerungsproteinen (SNAREProteinen) orchestriert, unter denen Syntaxin-1 (STX1) entscheidend ist. An die Plasmamembran durch eine Transmembrandomäne (TMD) verankert, interagiert STX1 mit den anderen beiden SNARE-Proteinen (Synaptobrevin-2 und SNAP-25) durch seine SNARE-Domäne, um den SNARE-Komplex zu bilden. Regulatorische Proteine einschließlich Synaptotagmin-1, Complexin und Munc18-1 interagieren ebenfalls mit STX1 durch die SNARE-Domäne. Zusätzlich hat STX1 viele andere regulatorische Domänen wie das N-Peptid, die Habc-Domäne, die Linker-Region und die Juxtamembran-Domäne (JMD). Das Verständnis der individuellen Rollen dieser Domänen kann uns helfen, den komplexen Prozess der Vesikelfusion zu entschlüsseln. In dieser Zusammenstellung von Studien nutzen wir ein Maus-Hippocampus- Neuronenmodell, dem STX1 fehlt (STX1-Null). In diesen STX1-Null-Neuronen können wir genetisch modifizierte Konstrukte von STX1 exprimieren, die in verschiedenen Domänen mutiert wurden. Dies erlaubte uns eine Struktur-Funktions-Analyse durchführen, die wir die elektrophysiologisch in kultivierten Neuronen untersuchten. Mit dem generellen Ziel, die spezifischen Rollen der einzelnen STX1-Domänen aufzuklären charakterisierten wir zuerst die Rolle des N-Peptids von STX1, das als unverzichtbar für die Funktion von STX1 bei der vesikulären Freisetzung gilt. Hierfür erstellten wir zunehmende Deletionen des N-Peptids bis hin zur Habc-Domäne von STX1 und exprimierten diese Mutantenkonstrukte in unserem STX1-Null-Neuronenmodell. Unsere Ergebnisse kamen zu dem Schluss, dass das N-Peptid entgegen von früheren Befunden nicht essentiell für die Neurotransmitter-Freisetzung ist. Jedoch identifizierten und charakterisierten wir eine regulatorische Rolle bei der Ca2+-ausgelösten Neurotransmitterfreisetzung hat. Als Zweites führten wir eine eingehende Analyse der Rolle der Juxtamembran-Domäne (JMD) und der Transmembran-domäne (TMD) von STX1 sowie der Rolle der Palmitoylierung dieser beiden Domänen auf die vesikulären Freisetzung durch. Hierzu erstellten wir zunächst STX1-Konstrukte mit Verlängerungen an beiden Seiten der JMD, um die genaue Funktion der Kontinuität zwischen SNARE-Domäne und JMD sowie zwischen JMD und TMD zu verstehen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die strukturelle Kontinuität zwischen SNARE-Domäne und JMD sowie zwischen JMD und TMD für spontane und Ca2+-ausgelöste vesikuläre Freisetzung wesentlich ist. Darüber hinaus zeigten Mutationen von Aminosäuren, die putative Ziele der Palmitoylierung dieser Domänen sind, dass die Palmitoylierung der TMD (die durch die JMD reguliert wird) ein wichtiger regulatorischer Mechanismus bei spontaner Freisetzung ist. Schließlich untersuchten wir die Funktion der SNARE-Domäne von STX1. Hierfür führten wir einen chimären Ansatz unter Verwendung von STX1 und einer Isoform, STX2, durch. Diese Analyse bestand darin, die N-terminale Hälfte, die C-terminale Hälfte oder die gesamte SNARE-Domäne zwischen den beiden Isoformen auszutauschen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die C-terminale Hälfte des SNAREKomplexes von STX1 eine regulatorische Funktion bei der Stabilität der geprimten Vesikel und bei der spontanen Freisetzung von Vesikeln hat. Darüber hinaus erstellten wir Punktmutationen in der C-terminalen Hälfte der SNARE-Domäne von Aminosäuren, die sich zwischen STX2 und STX1 unterscheiden, und stellten fest, dass die Aminosäuren D231 und R232 besonders wichtig für diese beiden Funktionen zu sein scheinen. Diese umfassende Studie trägt zu unserem Verständnis der nuancierten Mechanismen bei, die die Fusion synaptischer Vesikel steuern.