Charakterisierung von gpA33 und Eignung als Antikörper-Target

Abstract

Hintergrund: In der Therapie des kolorektalen Karzinoms wurden in den letzten Jahren neben der chirurgischen Resektion zunehmend multimodale Therapieansätze etabliert. Obwohl das kolorektale Karzinom weiterhin einer der führenden Ursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt ist, konnten neue Therapieoptionen wie antikörpergesteuerte Medikamente das Gesamtüberleben erheblich verbessern. Nichtsdestrotrotz ist angesichts der Inzidenz und Mortalität des kolorektalen Karzinoms der Bedarf für neue Therapiekonzepte gegeben. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Identifizierung und Charakterisierung des Antigens A33 zur Etablierung einer antikörpergesteuerte Therapie und die Einführung eines funktionierenden Antikörpers für dieses Antigen in vitro. Material und Methoden: Zur Untersuchung von Kolonkarzinomzellen der Zelllinien LIM1215 und CaCo2 in vitro und von Gewebsschnitten von kolorektalem Karzinomgewebe kamen FACS-Analyse, Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laser-Mikroskopie und PCR-Analyse als Untersuchungsmethoden zur Anwendung. Die Darstellung des auf der Zelloberfläche befindlichen Antigens gpA33 erfolgte mit dem Antikörper gpA33::rbGFP. Ergebnisse: Grundlage für diese Ergebnisse war der zunächst erbrachte Nachweis der Spezifität und Affinität von gpA33::rbGFP bei Zellen und an Gewebe von kolorektalem Karzinom. Es wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, dass die Expression von gpA33 auf der Zelloberfläche von Kolonkarzinomzellen über die Zeit keine Konstanz aufweist, sondern von der Umgebung der Zelle, ihrem Wachstumsgrad und der Phase des Zellzyklus, in dem sie sich befindet, abhängig ist. Die Expression von gpA33 auf der Zelloberfläche zeigt eine biphasische Proportionalität zur Dichte des Zellverbandes, in der sich die Zellen befinden. Wie gezeigt werden konnte, steigt der Expressionsgrad von gpA33 auf der Zelloberfläche mit der Zelldichte bis zum Konfluenzpunkt an, um danach wieder zu sinken. Daneben konnte erstmals nachgewiesen werden, dass ein Oberflächenantigen eine für die jeweilige Zellzyklusphase spezifisches Expressionsprofil aufweist. In der G2/M-Phase erreicht die Expression von gpA33 ihr Maximum, nachdem in der S-Phase der Expressionsgrad minimal war. Wir konnten daneben zeigen, dass nach Inkubationvon Kolonkarzinomzellen mit dem Antikörper gpA33::rbGFP eine teilweise Internalisierung des Antigen-Antikörper-Komplexes erfolgt, wobei der weitere intrazelluläre Weg und eine Rezirkulationan die Zelloberfläche nicht verfolgt werden konnte. Diskussion: Bisherige Arbeiten deuten darauf hin, dass es als transmembranales Glykoprotein an Zell-Zell-Interaktion und der Steuerung von Epithelwachstum und -differenzierung beteiligt ist. Die in- vitro-Expression von gpA33 auf kolorektalen Zellen unterliegt entsprechend den Ergebnissen dieser Arbeit nicht mehr dem eigentlichen physiologischen Ziel der Wachstumsregulation und -kontrolle sondern ist dysreguliert und bewirkt ein unkontrolliertes Wachstum, welches auch durch Adhäsion der Zellen mit Nachbarzellen in vollständiger Konfluenz nicht beeinflusst wird. Die in physiologischer Umgebung gezeigte Wachstumsinhibition durch Agglomeration geschieht hier nicht. Die Abnahme der Expression des Adhäsionsmoleküls nach Erreichen des Konfluenzpunktes könnte daneben die Bereitschaft der malignen Zellen zur Metastasierung zeigen. Eine entscheidende Einflussgröße auf den Grad der gpA33-Expression hat darüber hinaus die Zyklusphase, in der sich die jeweilige Zelle befindet. In der G2/M-Phase erreicht die Expression von gpA33 ihr Maximum, nachdem in der S-Phase der Expressionsgrad minimal war. Die Ergebnisse dieser Arbeit begründen die Hypothese, dass der Expressionsgrad von gpA33 auf der Zelloberfläche vom Zellzyklus abhängig ist, vom Wachstumsverhalten der einzelnen Zelle und des Zellverbandes beeinflusst wird und in maligne transformierten Zellen spezifisch und im Vergleich zur gesunden Zelle signifikant in höherem Maße exprimiert wird. Dies zeigt neue Ansätze für zukünftige Forschungsarbeiten auf, um weitere Antikörper-gesteuerte Therapieansätze für das kolorektale Karzinom zu etablieren. Die Überprüfung der Übertragbarkeit dieser Ergebniss auf in-vivo-Modelle ist ausstehend. Daneben steht zur weitergehenden Untersuchung die Frage, ob die hier nachgewiesenen Veränderungen der Antigenexpression in den jeweiligen Zyklusphasen für die Behandlung des kolorektalen Karzinoms therapeutische Ansätze eröffnen könnte und gegebenenfalls auf andere Tumorentitäten übertragbar ist.

Background: In the therapy of colorectal carcinoma multimodal concepts were introduced in the last years in addition to surgical approaches. Though being one of the leading causes with regard to morbidity and mortality in the Western hemisphere, new therapeutic approaches such as antibody directed drug administration helped to improve survival over the past years. Nevertheless, there still is strong demand and urgency to develop new therapy concepts due to the high incidence and mortality of colorectal carcinoma. The aim of this study was the identification and characterisation of gpA33 for the establishment of an antibody directed therapy and the introduction of an antibody in vitro. Materials and methods: For examination of colorectal cancer cells of the cell lines LIM1215 and CaCo2 in vitro and of sections of colorectal carcinoma tissue we performed FACS-analysis, fluorescence microscopy, confocal laser microscopy and PCR-analysis. We incubated cell lines and tissue with the antibody gpA33::rbGFP. Results: It could be demonstrated that binding of gpA33::rbGFP on colorectal cell lines and tissue was achieved with high specifity and affinity. In addition, it was shown, that gpA33 expression on the cell surface of colorectal carcinoma cells is dependent on culture density and cell-cycle phase. Expression of gpA33 shows a biphasic proportionality to culture density by increasing gpA33 expression until reaching confluence and decreasing afterwards. Furthermore, it was shown that gpA33 exhibits a cell-cycle specific expression profile: in S-phase expression of gpA33 is decreased compared to baseline whereas in G2/M there is a significant increase compared to S, and G1, respectively. We could show that after binding internalisation of the antigen-antibody-molecule takes place, though intracellular processing and recirculation could not be evaluated. Discussion: Studies have shown that gpA33 as a transmembranal glycoprotein functions in cell-cell-interaction and regulates epithelial growth and cell differentiation. According to this study gpA33-expression on colorectal carcinoma cells is dysfunctional and does not serve its original physiological function of growth regulation and inhibition. Thus uncontrolled growth, not influenced and regulated by cell adhesion, even in complete confluence, could be observed. The physiological growth inhibition due to agglomeration is dysregulated. The decrease of gpA33 expression after reaching confluence might exhibit the ability of malignant cells of metastatic spreading. Additionally, a crucial influence on gpA33-expression is executed by cell cycle phase. These results establish the hypothesis that the expression of gpA33 is cells is dependent on culture density and cell-cycle phase and and, furthermore, specifity and affinity of antibody binding are provided. Thus new doors for future studies are opened to establish antibody directed therapies in colorectal cancer. As a next step, transformation of these results into animal models is necessary. In addition, cell cycle dependent expression of gpA33 could offer the opportunity for sequential chemotherapy and might be applicable to other tumor entities.