Structural insights into the oligomeric assembly of EHD2 and its role at caveolae

Abstract

Eps15-homology domain containing protein 2 (EHD2) is a dynamin-related ATPase which is thought to localize to the neck of caveolae and participate in their stabilization at the plasma membrane. Similar to other members of the dynamin family, EHD2 oligomerizes upon recruitment to artificial lipid bilayers and induces membrane tubulation. X-ray crystallography and cryo-Electron Tomography (cryo-ET) studies indicated that EHDs exist as open dimers in solution and as closed oligomers on membranes, and that the transition between the two states is triggered by membrane curvature. However, structural and mechanistic details about how EHD2 restricts caveolae mobility, the regulatory roles of specific domains in oligomeric assembly and the coordination of the ATP hydrolysis cycle with conformational changes in EHD2 have remained obscure. To address these open questions, full-length (FL) and N-terminally truncated (ΔN) EHD2 were reconstituted on tubular membranes. Cryo-Electron Tomography (cryo-ET) and Subtomogram Averaging (StA) yielded structures of membrane-bound oligomeric EHD2-FL and EHD2ΔN at an average resolution of 6.7 and 11 Å, respectively, and a model of the EHD2 oligomers was obtained by a flexible fitting and refinement approach. EHD2 in its closed conformation forms ring-shaped oligomers, which embrace the most highly curved regions of the membrane tubules, while adjacent membrane regions without an EHD2 coat bulge out, suggesting membrane curvature stabilization via a scaffolding and wedging mechanism. In the cryo-ET map, an N-terminal sequence stretch projects towards the membrane. Its deletion did not abolish oligomerization and membrane tubulation but led to a tight compaction of adjacent EHD2 oligomeric filaments, in line with a role of the N-terminus in coordinating membrane binding with proper spatial organization of the EHD2 filaments in their environment. A large-scale movement consisting of distancing and rotation of the EH domains from their position in the closed EHD2 dimer, allows assembly via the G-interface, thereby explaining the auto-inhibition role of the EH domain. Biochemical and cryo-ET studies revealed that ATP binding is required for oligomeric assembly, whereas ATP hydrolysis appears to drive the disassembly. Finally, it was shown that the necks of caveolae are significantly narrower and more elongated in the absence of EHD2, supporting a role of EHD2 in the stabilization of caveolae at the plasma membrane. Results of this thesis refine our knowledge of the structural transition from EHD2 dimers in solution to ring-shaped filaments on membranes as a prerequisite to understand the cellular function of EHD2 in restricting caveolae to the plasma membrane.

Das „Eps15-homology domain containing protein 2 (EHD2)“ ist eine Dynamin-verwandte ATPase, von der man annimmt, dass sie am Hals von Caveolae lokalisiert ist und an deren Stabilisierung an der Plasmamembran beteiligt ist. Ähnlich wie andere Mitglieder der Dynamin-Familie oligomerisiert EHD2 nach Anlagerung an artifizielle Lipiddoppelschichten und induziert Membrantubulation. Röntgenkristallographie- und Kryo-Elektronentomographie-Studien deuten darauf hin, dass EHDs in Lösung als offene Dimere und auf Membranen als geschlossene Oligomere vorliegen und dass der Übergang zwischen den beiden Zuständen durch Bindung an gekrümmte Membranen ausgelöst wird. Strukturelle und mechanistische Details darüber, wie EHD2 die Mobilität von Caveolae einschränkt und wie spezifische Domänen die Oligomerbildung regulieren und den ATP-Hydrolysezyklus mit Konformationsänderungen koordinieren, sind jedoch unklar. Um diese offenen Fragen zu klären, wurde EHD2 in voller Länge (FL) und N-terminal verkürzt (ΔN) auf Membranentubuli rekonstituiert. Strukturen von membrangebundenen EHD2-FL und EHD2ΔN-Oligomeren wurden mittels Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) und Subtomogram Averaging mit einer durchschnittlichen Auflösung von 6,7 bzw. 11 Å gelöst, und ein Modell der Oligomere durch flexible Einpassung und Verfeinerung erstellt. EHD2 bildet in seiner geschlossenen Konformation ringförmige Oligomere aus, die die am stärksten gekrümmten Bereiche der Membrantubuli umschließen, während sich benachbarte Membranbereiche ohne EHD2-Hülle ausbeulen, was auf eine Stabilisierung der Membrankrümmung durch einen Gerüst- und Einkeilungsmechanismus hindeutet. In der Kryo-ET-Karte ragt ein N-terminaler Sequenzabschnitt in Richtung der Membran; seine Deletion hob die Oligomerisierung und Tubulation nicht auf, sondern führte zu einer engen Verdichtung benachbarter oligomerer EHD2-Filamente. Dies steht mit einer Rolle des N-Terminus für der Koordinierung der Membranbindung mit der richtigen räumlichen Organisation der EHD2-Filamente in ihrer Umgebung in Einklang. Eine weitreichende Bewegung der EH-Domänen von ihrer Position im geschlossenen EHD2-Dimer zu einer neuen Stelle an der Oberseite des Filaments ermöglicht die Assemblierung über eine Interaktionsfläche in der GTPase-Domäne und erklärt damit die Rolle der EH-Domäne in der Autoinhibition. Biochemische und Kryo-ET-Studien ergaben, dass ATP-Bindung für den Zusammenbau des Oligomers erforderlich ist, während ATP-Hydrolyse dessen Abbau zu steuern scheint. Schließlich wurde gezeigt, dass die Hälse der Caveolae in Abwesenheit von EHD2 deutlich schmaler und länger sind, was die Rolle von EHD2 bei der Stabilisierung der Caveolae an der Plasmamebran unterstützt. Die Ergebnisse dieser Arbeit verfeinern unser Wissen zu den strukturellen Übergängen von EHD2-Dimeren in Lösung zu ringförmigen Filamenten auf Membranen als Voraussetzung, um die zellulären Funktion von EHD2 bei der Stabilisierung von Caveolae an der Plasmamembran besser zu verstehen.