Deficiency of the DNA repair protein nibrin increases the basal but not the radiation induced mutation frequency in vivo

Abstract

Einleitung: Nibrin (NBN) bildet zusammen mit MRE11 und RAD50 einen Komplex, der an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) und der Zellzyklusregulation beteiligt ist. Hypomorphe Mutationen von Komponenten des Komplexes führen beim Menschen zu Erkrankungen, die durch Radiosensitivität und eine stark erhöhte Tumorinzidenz des lymphoretikulären Systems charakterisiert sind. Mutationen des NBN- Gens resultieren im autosomal rezessiven Nijmegen Breakage Syndrom (NBS). Über 95% der NBS Patienten tragen dieselbe Mutation, eine 5bp-Deletion, die zu alternativer Translation und der Produktion eines aberranten Protein Fragments führt. Dieses Protein Fragment übernimmt partiell die Funktionen des Wildtyp-Nibrins. Null-Mutationen in Mäusen sind aufgrund erhöhter Apoptose im Blastozysten-Entwicklungsstadium embryonal letal. In der vorliegenden Arbeit haben wir den Zusammenhang von DNA- Schädigung, Mutationsrate und Mutationsspektrum in vivo und in vitro bei Mutationen von NBN untersucht. Zur in vivo Untersuchung wurden konditional null-mutante und humanisierte Mäuse mit der 5bp-Deletion verwendet. Diese Mäuse wurden mit einer transgenen Maus, die das bakterielle LacZ- Reporterplasmid trägt, gekreuzt. Es wurden sowohl homozygote als auch heterozygote Mäuse untersucht. Aus diesen Mäusen gewonnene Fibroblasten wurden verwendet, um den Zusammenhang von DNA- Schädigung, Mutationsrate und Mutationsspektrum in vitro zu untersuchen. Ergebnisse: Es zeigte sich, dass Mutationen von NBN zu erhöhten spontanen DNA-Schädigungen in vitro führen. In vivo konnte im Vergleich zu Kontroll-Mäusen eine 2.5-fache Erhöhung der basalen Mutationsrate in den lymphatischen Organen der humanisierten Maus gezeigt werden. Im Gegensatz zu den nach defekter DSB-Reparatur erwarteten komplexen Mutationen wiesen die untersuchten Zellen und Mäuse ein von Einzelbasenpaar-Veränderungen dominiertes Mutationsspektrum auf. Schlussfolgerung: Die Reparatur von spontanen Mutationen, möglicherweise entstanden durch fehlerhafte DNA-Replikation, spielt in Abwesenheit von Wildtyp-Nibrin eine große Rolle bei der Entstehung der erhöhten basalen Mutationsrate. Dies gilt auch für Zellen, die heterozygot für NBN- Nullmutationen sind. NBS Patienten-Zellen zeigen in vitro eine erhöhte Strahlensensitivität. Doch eine Erhöhung der Mutationsraten nach Bestrahlung ist in vivo nicht zu beobachten, was vermutlich auf eine intakte Apoptose in Abwesenheit von Wildtyp-Nibrin hindeutet.

Introduction: Nibrin (NBN) is a member of a DNA repair complex together with MRE11 and RAD50. The complex is associated particularly with the repair of DNA double strand breaks and with the regulation of cell cycle check points. Hypomorphic mutation of components of the complex leads to human disorders, characterised by radiosensitivity and increased tumour occurrence, particularly of the lymphatic system. Mutations of the NBN gene result in the autosomal recessive Nijmegen Breakage Syndrome (NBS). Over 95% of NBS patients carry the major NBN mutation, a 5bp deletion, which leads to alternative translation and the production of a truncated protein fragment. This protein fragment maintains partial nibrin function. Null mutations in mice are embryonically lethal due to massive apoptosis at the blastocyst stage. Little is actually known about the relationship between DNA damage, mutation frequency and mutation spectrum in the absence of wild type nibrin. We have utilised a conditional null mutant mouse and a humanized NBS mouse, which carries the 5bp deletion, to examine this relationship in vivo. Mice homozygous and heterozygous for nibrin mutations were examined. We have bred these mice with a transgenic mutagenesis mouse harbouring copies of the bacterial lacZ gene. Fibroblasts derived from the different mice were used to examine DNA damage, mutation frequency and spectrum in vitro. Results: We find that NBN mutation leads to increased DNA damage in vitro, even in the absence of an external genotoxic treatment. In vivo we find the basal mutation frequency measured in lymphatic tissue of the humanized NBS mice is approximately 2.5-fold higher than in control mice. The characteristic mutation spectrum is dominated by single base transitions rather than the deletions and complex rearrangements expected after abortive repair of DNA double strand breaks. Conclusion: We conclude that in the absence of wild type nibrin, the repair of spontaneous errors, presumably arising during DNA replication, make a major contribution to the basal mutation rate. This applies also to cells heterozygous for an NBN null mutation. Mutation frequencies after irradiation in vivo were not increased in mice with nibrin mutations as might have been expected considering the radiosensitivity of NBS patient cells in vitro. Evidently apoptosis is efficient, even in the absence of wild type nibrin.