Mucin-linked regulatory factors in C. jejuni infections and advances in spheroid modeling

Abstract

Campylobacter jejuni is a prevalent zoonotic pathogen and the most common source of bacterial intestinal infections worldwide. However, the pathogenesis of the infection is not fully understood and detailed research on the underlying molecular mechanisms of many host-pathogen factors involved in colonization and infection is needed. C. jejuni has adapted several methods to penetrate the double mucus layer in the human colon, infect the epithelium and cause acute inflammation processes. Main component of this protecting barrier is MUC2, which is highly glycosylated by mucin-type O-glycosylations through specific glycosyltransferases. The expression of several glycosyltransferases involved in mucin-type O-glycosylation is dysregulated in C. jejuni infections, which may affect the mucosal defense mechanisms and influence the severity of the infection. miRNAs play an important role in controlling mammalian host cell responses to bacterial infections. It was shown that the mucin-associated miRNAs miR-125a-5p and miR-615-3p are dysregulated in C. jejuni infections. Moreover, a potential regulation of miR-125a-5p on the expression of the sialyltransferase St3gal1 and the glycosyltransferase B4galt1 was demonstrated by combining in silico, in vitro and in vivo approaches. St3gal1 and B4galt1 are both involved in mucin-type O-glycosylations and significantly upregulated in an infection-dependent manner in the colon of C. jejuni infected mice compared to naïve control animals. Hence, miR-125a-5p possibly participates in regulating the glycosylation pattern of important host cell response proteins like MUC2 upon infection. For further investigations, human structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) were generated. This advanced 3D cell culture model comprises of four relevant cell lines, with a fibroblast core that is surrounded by a single layer of enterocytes, goblet cells and activated monocytes. SMIS thereby replicate the microarchitecture of the luminal surface of the human intestinal mucosa. Further, the spheroids show differentiated morphological characteristic like microvilli after only two days in culture. SMIS were specifically designed to study molecular mechanisms following the infection by intestinal pathogens. After C. jejuni infections, they exhibit regulatory patterns of immunological markers that surpass 2D monolayers and closely align with in vivo responses to the infection. The human SMIS protocol is adaptable to the species mouse and pig, demonstrating its versatility.

Campylobacter jejuni ist ein weit verbreitetes zoonotisches Pathogen und die häufigste Ursache bakterieller intestinaler Infektionen weltweit. Die Pathogenese der Infektion ist jedoch unzureichend erforscht und bedarf weiterführender Untersuchungen hinsichtlich der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen von Wirt und Pathogen, die an Kolonisation und Infektion beteiligt sind. C. jejuni hat verschiedene Methoden entwickelt, um die schützende doppelte Mucus-Schicht im menschlichen Colon zu durchdringen, um dann das Epithelium zu infizieren und akute Inflammationsprozesse auszulösen. Hauptbestandteil dieser schützenden Barriere ist MUC2, das durch muzinartige O-Glykosylierungen, die von spezifischen Glykosyltransferasen katalysiert werden, stark glykosyliert ist. Die Expressionen mehrerer Glykosyltransferasen, die an muzinartigen O-Glykosylierungen beteiligt sind, sind bei C. jejuni Infektionen dysreguliert. Diese Veränderung kann die mukosalen Abwehrmechanismen beeinträchtigen und die Schwere der Infektion beeinflussen. miRNAs spielen in Säugetieren bei der Kontrolle der Wirtszellantwort auf bakterielle Infektionen eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass die muzin-assoziierten miRNAs miR-125a-5p and miR-615-3p in C. jejuni Infektionen dysreguliert sind. Darüber hinaus konnte eine mögliche Regulation von miR-125a-5p auf die Expression von der Sialyltransferase St3gal1 und die Glykosyltransferase B4galt1 durch die Kombination von in silico, in vitro und in vivo Methoden nachgewiesen werden. St3gal1 und B4galt1 sind beide an muzinartigen O-Glykosylierungen beteiligt und bei einer Infektion im Colon von C. jejuni infizierten Mäusen verglichen mit nicht-infizierten Kontrolltieren signifikant hochreguliert. Daraus ist zu schließen, dass miR-125a-5p Teil der Regulationsprozesse von Glykosylierungsmustern wichtiger Wirtszellenproteine als Antwort auf Infektionen ist. Für weiterführende Untersuchungen wurden menschliche strukturierte multizelluläre intestinal Sphäroide (SMIS) entwickelt. Dieses 3D-Zellkulturmodell besteht aus vier relevanten Zelllinien mit einem Fibroblastenkern, der von einer Einzelschicht aus Enterozyten, Becherzellen und aktivierten Monozyten umgeben ist. Damit repliziert SMIS die Mikroarchitektur der luminalen Oberfläche der menschlichen intestinalen Mukosa. Zusätzlich weisen die Sphäroide bereits nach zwei Tagen in Kultur differenzierte morphologische Merkmale wie Mikrovilli auf. SMIS wurden speziell dafür entwickelt, molekulare 3 Mechanismen nach Infektionen mit Darmpathogenen zu untersuchen. Nach C. jejuni Infektion zeigen sie regulatorische Muster immunologischer Marker, die die von 2D-Monolayern übertreffen und die den in vivo Reaktionen auf die Infektion stark ähneln. Das menschliche SMIS-Protokoll ist auf die Spezies Maus und Schwein übertragbar, was dessen Vielseitigkeit demonstriert.