The lack of germline-competent ES cells makes gene inactivation through homologous recombination impossible in the rat. The main goal of this thesis was to solve this problem by establishing a new gene down regulation technology using shRNA, a natural phenomenon and a powerful tool for gene knockdown in mammalian cells and mice. Three DNA constructs harbouring hairpin cassettes against the EGFP gene and controlled by the U6 promoter were generated. After standard pronuclear microinjection into zygotes of EGFP transgenic rats more than three hundred rats were born. Surprisingly, only one animal was found to carry the construct integrated into the genome. No GFP silencing was observed in this transgenic founder nor was any shRNA expression detectable. Even the use of BAC constructs based on the mouse Rosa26 locus to achieve single transgene integration did not result in successful generation of shRNA transgenic rats. Suspecting embryo-toxicity by abundant production of shRNA molecules an in vitro study was carried out. By assaying embryonic development and survival rate of rat and mouse embryos after introduction of a hairpin construct it was shown that shRNA expression does not disturb embryonic development at early preimplantation stages. Consequently, the problem may appear later during pregnancy. Since pronuclear microinjection of ubiquitously and permanently active shRNA constructs does not work in the rat as shown in this thesis, a novel strategy to achieve conditional gene knockdown was tested. For this purpose, a tetracycline activatable system was used to control the expression of shRNA against the insulin receptor (InsR), resulting in an inducible model of insulin resistance. Consequently, an inducible and chronic model of type II diabetes including several hallmarks of this disease was established. In addition, a novel inducible expression system for shRNA was developed using a ligand-dependent chimeric transcription factor. As demonstrated in cell culture, a mutated TATA-binding protein (mTBP) activates a U6 promoter with a corresponding TATA box mutation. The fusion of a mutated ligand binding domain of an estrogen receptor to the mTBP leads to a chimeric protein. The translocation of the fusion protein into the nucleus should depend on the presence of tamoxifen. However, this ligand-inducibility of the mTBP could not be achieved in this thesis. In conclusion, with the use of the doxycycline inducible shRNA expression system, time and/or dose dependent gene inhibition in rats becomes possible. This flexible gene manipulation strategy in the preferred animal model for physiopathological studies may provide a powerful tool for the understanding of gene function.
Durch das Fehlen Keimzell-kompetenter embryonaler Stammzellen in der Ratte ist die Geninaktivierung durch homologe Rekombination nicht möglich. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, dieses Problem durch die Etablierung einer neuen Technologie zum Herunterregulieren von Genen durch Nutzung von shRNA zu lösen, einem natürlichen Phänomen und einem Werkzeug zum Ausschalten von Genen in Säugerzellen und in Mäusen. Es wurden drei DNA-Konstrukte generiert, die Hairpin-Kassetten gegen das EGFP-Gen beinhalteten und unter der Kontrolle des U6-Promotors standen. Nach einer standardmäßigen pronukleären Mikroinjektion in Zygoten von EGFP-transgenen Ratten wurden mehr als dreihundert Ratten geboren. Überraschenderweise hatte nur ein Tier das Konstrukt in das Genom integriert. In diesem transgenen Founder wurde weder GFP-Silencing beobachtet noch war shRNA- Expression nachweisbar. Sogar die Nutzung eines BAC-Konstrukts basierend auf dem Rosa26-Lokus der Maus, um eine einzelne transgene Integration zu erreichen, resultierte nicht in der erfolgreichen Generierung von shRNA-transgenen Ratten. Aufgrund einer vermuteten Embryo-Toxizität durch die starke Produktion von shRNA-Molekülen sein könnte, wurde eine in vitro Studie durchgeführt. Die Untersuchungen der embryonalen Entwicklung und die Überlebensrate von Ratten- und Mäuseembryos nach der Injektion eines Hairpin- Konstrukts bewiesen, dass die Expression der shRNA die embryonale Entwicklung im frühen Präimplantations-Stadium nicht stört. Folglich sollte das Problem später in der Schwangerschaft auftreten. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, funktioniert die pronukleäre Mikroinjektion ubiquitär und dauerhaft aktiver shRNA-Konstrukte in der Ratte nicht. Deshalb wurde eine neue Strategie getestet, um eine konditionelle Gen-Ausschaltung zu erreichen. Für dieses Vorhaben wurde ein durch Tetrazyklin aktivierbares System benutzt, welches die Expression von shRNA gegen das Gen für den Insulin Receptor (InsR) kontrolliert, woraus ein induzierbares Model der Insulinresistenz resultierte. Somit war ein induzierbares und chronisches Modell für Typ II Diabetes etabliert, das verschiedene Merkmale dieser Krankheit aufwies. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines Liganden-abhängigen chimären Transkriptionsfaktors ein neues induzierbares Expressionssystem für shRNA entwickelt. In Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass ein mutiertes TATA-bindendes Protein (mTBP) einen U6 Promotor mit einer entsprechenden TATA-Box-Mutation aktiviert. Die Fusion einer mutierten Liganden-Bindungsdomäne eines Estrogenrezeptors mit dem mTBP führt zu einem chimären Protein. Die Translokation des Fusionsproteins in den Nukleus sollte von der Anwesenheit von Tamoxifen abhängig sein. Jedoch konnte diese Liganden- Induzierbarkeit des mTBP in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Zeit und/oder Dosis abhängige Gen- Inhibierung in Ratten durch die Nutzung des Doxycyclin induzierbaren shRNA Systems möglich ist. Diese flexible Genmanipulationsstrategie in dem bevorzugten Tiermodell für physiopathologische Studien kann ein starkes Werkzeug für das Verständnis von Genfunktionen werden.
