Zytoprotektive Mechanismen therapeutischer Hypothermie in Mikrogliazellen im Ischämie/Reperfusions-Modell

Abstract

Background: Despite promising results in preclinical studies, therapeutic hypothermia (TH) has not been fully established in clinical practice of cerebral ischemia/reperfusion (I/R) pathologies. Microglia play an ambivalent role as initiators of both inflammatory and cytotoxic as well as neuroregenerative processes. Precise characterization of TH-mediated effects on a cellular level could reveal new therapeutic strategies. Therefore, the aim of this study was to investigate the impact of TH on cell death mechanisms, sterile inflammation, and the expression of cytoprotective cold shock proteins in I/R damaged microglial cells.

Methods: Murine BV-2 microglia were exposed to simulated ischemia (oxygen-glucose-deprivation, OGD; 0.2 % O2 and glucose/serum-deprived medium) for 2 or 6 hours, followed by 3-, 6- or 19-hours reperfusion (OGD/R, 21 % O2 and full medium). Cells were maintained at either normothermia (37 C°) or cooled to 33.5 °C (moderate TH) 1 hour after start of the experiment. Necrotic cell death was determined using the LDH assay. Apoptotic cell death was assessed by cleavage of caspases 3, 8 and 9 and detected by Western blotting. Western Blotting was also used to quantify the cytotoxic damage-associated molecular patterns (DAMPs) CIRBP, HMGB1 and Hsp70 in the cell culture supernatant, as well as intracellular cytoprotective cold shock proteins CIRBP and RBM3. Extracellular TNF-α was assessed via ELISA. RT-qPCR was used to quantify primary pro- (TNF-α, IL-6, IL-1b, IL-1α) and anti-inflammatory (TGF-b, IL-10) cytokines, oxidative stress (iNOS), microglial activity (AIF-1, MCP-1), and cold shock proteins at the gene expression level.

Results: Moderate TH reduced OGD-induced necrosis. However, TH-mediated regulation of apoptosis and OGD-induced iNOS expression was not observed. OGD caused the release of cytotoxic DAMPS with CIRBP release being significantly attenuated by cooling. Cooling also significantly stimulated cold shock proteins CIRBP and RBM3 gene and protein expression. Contrary to our expectations, OGD resulted in suppressed gene expression of microglial activity markers AIF-1 and MCP-1 and cytokines IL-1b, TNF-α, TGF-b and IL-10, whereas moderate TH induced their expression, particularly under normoxic conditions.

Conclusion: Moderate TH provided cytoprotective mechanisms by reducing necrotic cell death and release of cytotoxic DAMPs, along with induction of neuroprotective cold shock proteins CIRBP and RBM3 in OGD/R-damaged microglial cells. The partial TH-induced expression of mediators of microglial activity and sterile inflammation requires further research considering the dual role of microglial cells in I/R injury.

Hintergrund: Trotz vielversprechender Ergebnisse in präklinischen Studien hat sich die therapeutische Hypothermie (TH) in der Behandlung zerebraler Ischämie/Reperfusions(I/R)- Pathologien in der klinischen Praxis nicht vollständig etabliert. Mikrogliazellen spielen dabei als Initiatoren sowohl inflammatorischer und zytotoxischer als auch neuroregenerativer Prozesse eine ambivalente Rolle. Die präzise Charakterisierung der TH-vermittelten Effekte auf zellulärer Ebene könnte neue Interventionsstrategien aufzeigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Einfluss der TH auf Zelltodmechanismen, sterile Inflammation und die Expression zytoprotektiver Kälteschockproteine in Mikrogliazellen im I/R-Geschehen zu untersuchen.

Methoden: Murine BV-2-Mikrogliazellen wurden einer 2- oder 6-stündigen simulierten Ischämie (Oxygen-Glucose-Deprivation, OGD mit 0,2 % O2 und Glukose-/Serumfreiem Mangelmedium) ausgesetzt, gefolgt von 3-, 6- oder 19-stündiger Reperfusion (OGD/R, 21 % O2 und Vollmedium). Es wurde zwischen normo- (37 °C) und hypothermen (33,5 °C) Versuchsgruppen unterschieden, wobei moderate TH 1 Stunde nach Versuchsbeginn initiiert wurde. Nekrotischer Zelltod wurde mittels LDH-Assay, apoptotischer Zelltod via Spaltung der Caspasen-3, -8 und -9 in der Western Blot-Analyse quantifiziert. Die zytotoxischen Damage- associated molecular patterns (DAMPs) CIRBP, HMGB1 und Hsp70 wurden im Zellkulturüberstand ebenso wie die intrazellulär zytoprotektiven Kälteschockproteine CIRBP und RBM3 mittels Western Blot-Analyse bestimmt. Weiterhin wurde das Zytokin TNF-α via ELISA im Zellkulturüberstand analysiert. Die RT-qPCR diente der Quantifizierung primär pro- (TNF-α, IL-6, IL-1b, IL-1α) und anti-inflammatorischer (TGF-b, IL-10) Zytokine, des oxidativen Stresses (iNOS), mikroglialer Aktivität (AIF-1, MCP-1) und der Kälteschockproteine auf Ebene der Genexpression.

Ergebnisse: Moderate TH reduzierte OGD-induzierte Nekrose, eine signifikante Regulation der Apoptose und der OGD-induzierten iNOS-Expression durch TH zeigte sich nicht. In Analogie zum nekrotischen Zelltod verursachte OGD eine Freisetzung der DAMPs, wobei TH diese im Falle von CIRBP signifikant minderte. Mit zunehmender TH-Dauer wurde weiterhin die Gen- und Proteinexpression der zytoprotektiven Kälteschockproteine CIRBP und RBM3 induziert. Entgegen den Erwartungen führte OGD zur supprimierten Genexpresssion der mikroglialen Aktivitätsmarker AIF-1, MCP-1 und der Zytokine IL-1b, TNF-α, TGF-b und IL- 10, wohingegen TH insbesondere unter Normoxiebedingungen deren Expression stimulierte.

Schlussfolgerung: Moderate TH konnte Zytoprotektion durch Reduktion des nekrotischen Zelltods und der Freisetzung von DAMPs sowie der Induktion der Kälteschockproteine CIRBP und RBM3 in OGD/R-geschädigten Mikrogliazellen vermitteln. Die teils durch TH induzierte Expression von Mediatoren mikroglialer Aktivität und steriler Inflammation bedarf in Hinblick auf die duale Rolle von Mikrogliazellen im I/R-Geschehen weiterer Forschung.